液質(zhì)聯(lián)用知識(shí)

1、前言:如何利用LC-MS/MS,更快更好的建立生物樣品分析 方法？前言:以前曾在實(shí)驗(yàn)室的seminar上，做過一次關(guān)于如何建立生物樣品分析方法的工作報(bào)告。時(shí)隔兩年，恰逢儀器信息網(wǎng)舉辦第一屆網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽，在這里將這幾年來對(duì)于生物樣品分析的一點(diǎn)點(diǎn)感受總結(jié)一下，與大家交流、分享。首先明確一下文中提到的“生物基質(zhì)”，主要指的是血漿、血清、唾液、尿液或者器官組織等。 藥物透過機(jī)體的各種生理屏障，進(jìn)入到這些基質(zhì)中，就是我們所說的生物樣品” （Biosample）。生物樣品中的藥物濃度極低，我們?nèi)绾卫渺`敏度高的儀器如LC-MS/MS， 更好的建立測(cè)定生物樣品中藥物濃度的分析方法呢？下面我主要從以下四

2、個(gè)方面進(jìn)行闡述:一、色譜-質(zhì)譜條件的確立1、質(zhì)譜條件的確立當(dāng)使用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)某一個(gè)化合物進(jìn)行定量分析時(shí)，我們就需要建立一個(gè)質(zhì)譜分析方法。雖 然儀器的型號(hào)不盡相同，但原理卻是一致的，基本原理如圖所示。我們?cè)诖_定方法時(shí)，主要 考慮以下幾個(gè)因素：（1）化合物的性質(zhì):包括化合物的結(jié)構(gòu)、化合物的極性及化合物的pKa值。首先了解化合 物的結(jié)構(gòu)，我們可以大概的推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩(wěn)定的碎片離子作為定量 反應(yīng)的子離子，也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷選用哪種source更為合適；根據(jù)化合物的極性大小， 我們可以選擇一種或幾種恰當(dāng)?shù)娜軇┳鳛槿苊剑饶鼙ＷC完全將樣品溶解，又能提高化合物 的質(zhì)譜響應(yīng)；而清楚化合物的

3、pKa值，有助于我們選擇流動(dòng)相的添加劑及其pH值，從而提高質(zhì)譜響應(yīng)。（2）流動(dòng)相添加劑的選擇:在液相紫外檢測(cè)中，我們使用的添加劑的種類繁多，可以是揮 發(fā)性的酸或者堿（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易揮發(fā)的緩沖鹽（如磷酸二氫鈉- 磷酸緩沖液、磷酸二氫鉀-磷酸緩沖鹽）。但是在液質(zhì)分析中，基于質(zhì)譜檢測(cè)的原理，我們 只能使用可揮發(fā)的酸堿或緩沖鹽，那么種類就會(huì)受到極大的限制。在日常分析中使用到的添 加劑主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽，見圖一。三乙胺在紫 外檢測(cè)中，常作為掃尾劑，但是在液質(zhì)檢測(cè)中是絕對(duì)禁止的。因?yàn)槿野愤M(jìn)入質(zhì)譜后不易清 除，殘留及其嚴(yán)重，能夠抑制離子的響應(yīng)。一

4、旦三乙胺用量增加，時(shí)間延長(zhǎng)，那么慢慢地質(zhì)譜就不能靈敏的檢測(cè)化合物了，所以這點(diǎn)大家要注意，尤其對(duì)于液質(zhì)的初期使用者。圖一液質(zhì)分析中推薦使用的流動(dòng)相和添加劑推薦使用不推薦使用，盡乾不使用存機(jī)潛劑jz+n：乙席.二氧甲焜 正札叫t 瓠化曜甲部、乙神、昇丙醉、己靛葦，環(huán)己焜.H雌沖波乙般楨、甲瀏S酸碗莢他乙酸.甲酸.:#，乙憤正尚r ）埔酸，商氯酸.嬉酸、借酸.橫彼 季胺-做碰、三匕肢掐潔制、表面沃牲削沮j-對(duì)軾劑、dick*aiHR2CG8.3）質(zhì)譜離子源的選擇:質(zhì)譜出現(xiàn)早期，主要有電子轟擊源（EI）、化學(xué)電離源（CI）、電 噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，

5、源的發(fā)展也是 日新月異。目前，用于定量的離子源主要是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI），他們的使用范圍如圖二所示。圖二12341010101010MALDIa LG -4*cc oCLGCGCLC MALDIVolatilityESI源是液相離子化，主要用于分析極性比較大的化合物及大分子化合物；而APCI源是氣 相離子化，主要用于分析極性較小的小分子化合物。在掌握以上基本信息后，根據(jù)各個(gè)型號(hào)儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行操作，對(duì)各個(gè)參 數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而確定質(zhì)譜分析方法。2、色譜條件的建立在液相色譜紫外檢測(cè)中，要求化合物之間的分離必須達(dá)到完全分離，即R1.5，如果進(jìn)行 定量，

6、那R最好沱2.0，這就給分析工作者提出了很高的要求一一準(zhǔn)確的配制流動(dòng)相，精確 的調(diào)好流動(dòng)相的pH及添加劑的濃度。但在液質(zhì)分析中，我們經(jīng)常使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM/SRM)對(duì)化合物進(jìn)行定量，由于MRM要求選擇兩次離子，因此它具有很高的專屬 性，基于這點(diǎn)我們對(duì)多個(gè)化合物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不需要彼此間達(dá)到完全分離就可以對(duì)他們 進(jìn)行定量分析。但這里需要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，由于生物樣品中含有大量的基質(zhì)，這些基質(zhì)的存 在會(huì)嚴(yán)重的干擾和影響化合物的測(cè)定，因而我們需要利用色譜將化合物與基質(zhì)分開，從而降 低基質(zhì)效應(yīng)的影響，即降低離子抑制。二、內(nèi)標(biāo)的選擇檢測(cè)時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物的目的是消除操作誤差，因此我們?cè)谶M(jìn)行生物樣品分析時(shí)必須

7、選擇一個(gè)合 適的化合物作為內(nèi)標(biāo)物。LC/MS/MS法的高專屬性使其對(duì)內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物的色譜分離要求 不高，但要求內(nèi)標(biāo)物色譜行為及提取回收率，尤其是質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)與待測(cè)物的接近；要求在 測(cè)定過程中內(nèi)標(biāo)物受系統(tǒng)誤差及碰撞壓力變化的影響與待測(cè)物一致。所以理想的內(nèi)標(biāo)物應(yīng)為 待測(cè)組分的同位素標(biāo)記物，但由于同位素標(biāo)記物價(jià)格非常昂貴且不易獲得，我們嘗試選用結(jié) 構(gòu)相似的化合物（或者同系物）作為內(nèi)標(biāo)物。三、樣品預(yù)處理方法的選擇根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，我們?cè)谏飿悠奉A(yù)處理中，經(jīng)常使用到的方法主要有以下三種一一沉淀蛋 白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE），而這三種方法的選擇，主要取 決于化合物的特性。分析

8、極性比較大的化合物，優(yōu)先考慮使用沉淀蛋白法，這種方法操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力；缺點(diǎn) 是生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)去除的不徹底，基質(zhì)效應(yīng)較大，使得方法靈敏度不高。分析極性較小的化合物，我們可以選擇液液萃取法，這種方法根據(jù)相似相溶的原則進(jìn)行分離 提取，優(yōu)點(diǎn)在于處理完的樣品較干凈，內(nèi)源性物質(zhì)去除徹底；缺點(diǎn)在于消耗有機(jī)試劑的量很 大，對(duì)操作人員、環(huán)境的污染也大。固相萃取法，在國外使用尤為廣泛。它采用固相萃取小柱作（見圖三）為分離媒介，小柱中 添加了不同填料的固定相，如以鍵合硅膠為基質(zhì)的如C18、NH2、COOH、PSA、SAX等， 是硅膠的表面活性大為降低，最大程度的降低了極性化合物的不可吸附和拖尾，使樣品回收 率和重現(xiàn)性得到保障；以高分子聚合物為基質(zhì)的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高純 度、高比表面的特點(diǎn)；以吸附型填料為固定相的如硅酸鎂、氧化鋁等，主要通過表面的極性 吸附達(dá)到分離