CART細(xì)胞治療質(zhì)量控制淺談

1、CAR-T細(xì)胞治療質(zhì)量控制淺談細(xì)胞治療，將改變?nèi)祟惣膊〉闹委煼妒?，由過(guò)去重復(fù)的癥狀控制轉(zhuǎn)為一次性的治愈，是引領(lǐng)生物醫(yī)學(xué)的希望。其中，嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法是近年來(lái)發(fā)展非常迅速的一種細(xì)胞治療技術(shù)。目前在全球已有兩款藥物獲得FDA的批準(zhǔn)上市，分別是諾華的Kymriah和凱特的YESCARTA，中國(guó)有多家公司產(chǎn)品進(jìn)入臨床申報(bào)階段，這種療法已成為更多患者的選擇，CAR-T細(xì)胞制造過(guò)程符合全球監(jiān)管要求成為廣泛討論的話題。1中國(guó)正衽申報(bào)臨床的I南示傳奇生物科技科濟(jì)生物制藥藥明巨諾重慶精準(zhǔn)醫(yī)療上海叵潤(rùn)達(dá)生復(fù)星凱特北京藝妙神州科技上海優(yōu)卡迪生物中源協(xié)和北京馬力喏生物博生吉醫(yī)藥科技恒瑞源正生物細(xì)胞治療

2、質(zhì)量控制分析其中細(xì)胞質(zhì)量控制貫穿CAR-T從研發(fā)到臨床的所有步驟，但CAR-T作為“活”的藥物,其很多特性與傳統(tǒng)藥物有很大的差別，下表列舉了與傳統(tǒng)藥物的主要差異點(diǎn)：第一個(gè)上市的CAR-T藥物Kymriah的釋放標(biāo)準(zhǔn)涉及到多個(gè)方面的指標(biāo)，下圖是小編收集到的Kymriah的釋放指標(biāo)所需要測(cè)試的實(shí)驗(yàn)：Titbit工.KYMRJAHLol亡TestRequirTnentsftjrcommercialuseSampleufiedf(rtellingAppearanceColorlesstosightlyyellowformulatedproduct(b)(4)IdentitybyCARq-PCKPosi

3、tiveforPCR.signal(b)(4)Pert少詛雛ofviableTedh(b)4)Finslproduct(b)(4)DeterminatjonoftransHuctifinefficientbyCAR-q-PCR)(b)(4)1PercentageofnahJcCD19+Bcelk何糾Finalprnduil(b)(4)TotalceDtoimHReportcells/niLFinalproduct(b)(4)Numberoftnablecells(calculated)(b)(4)totalviablecellsFinn!prodnd(b)(4)Dose(calculateda

4、.nto5.0 xCARpositiveviableTcells/bodyweight(550k耳j0,to2.5xioflCARpositiveviableTcellstFinalprcjJucL(sflertliawj2Caktilationformula；(%C14.K唧w船knxViabfemW畑玳rmioHxVohtmcperdQx)/ioofperpatients(.50legth應(yīng)nujbberisdiuidetlperKybodi/iLviyht)DeterminationctfCARexprcsskinhyflow(ytometry(b)(4)Finalproduct(b)(

5、4)ReleaseofIFNyonresponsetoCD19-expressingtargeteellst）Finalproduct(b)(4)BjicterijilEndotoxins(b)(4)Finalprodnc1(b)(4)SterilityNegiliv-6岀li加由iphdiiib)(4)MycoplasmaNtfgilivii(b)Dctcrminati0】tofVSV-GDMAbyqujintitatiePCR(qFCR)(b)(4).何KITE的YESCARTA的質(zhì)量控制也涉及到非常多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，篇幅有限，就不一一列舉了，具體指標(biāo)可參考如下的鏈接： HYPERLINK

6、/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProdu /downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM584335.pdf另一方面CAR-T制造工藝復(fù)雜，下圖列舉了CAR-T的制作流程，其中涉及到病毒轉(zhuǎn)染，外源物質(zhì)的引進(jìn)，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)等因素，這勢(shì)必對(duì)質(zhì)量控制提出了巨大的挑戰(zhàn)。MolecularTherapyOncolytics(2016)16015細(xì)胞治療質(zhì)量控制原則及法規(guī)基于以上原因，CAR-T細(xì)胞質(zhì)量控制特別強(qiáng)調(diào)制

7、備工藝的穩(wěn)定性、多批次驗(yàn)證、全程質(zhì)控和按照SOP嚴(yán)格操作。要建立穩(wěn)定的質(zhì)量檢驗(yàn)和放行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)和歐洲出臺(tái)了相應(yīng)的法規(guī)來(lái)規(guī)范細(xì)胞治療的質(zhì)量控制，以下是國(guó)外針對(duì)細(xì)胞治療出臺(tái)的相關(guān)政策法規(guī)：FDA#GuidanceforIndustry：GuidanceforHlumanSomaticCllTh電wpyandGeneTherapy(RockvillfijMDrMar.1998).FDA.GuidenesforIndustry：SwpplemenUllGuidnc?onTestingforReplicationCmpetentRetrovirusinRetroviralVictorBaedlGen

8、eTherapyProdmctsandDuringFolbw-upofPtienisinClinicalTrialsUsingRetroviralVectors(Rockville,MUNov.300&).FDA,GuidanceforFDAReviewersandSponsors;ContentndReviewofCherni5tryrManufacturing,andControl(CMC)lnformaUoriforHumanSomiaticCellTherapyInvestigationalNewDrugAppli匚ztion與(INDe)(R匚kville,MD.Apr.2003).

9、IFDA.GuidanceforIndustry；PotencyTestsforCellularandGeneTherapyProducts(Rockville.MD(Jan.2011).FDA,GuidanceforIndustryPireclinbca)AssessmentofInves-tigationalCelliuhrandGeneTherapyProducts(Rockville.MDrNov.2012),USP.USPGneralChapter,CellandGnTherapyProducts(RockvilleMD,2011).EMA.GuidelineonDevelopmen

10、taodManufactureofLentivirsalVectorsLondonhMay2005)-EDQM.EurPhjGeneTransferMedicinalProductsforHucnanUm5.14(EDQM.Strasbourg.France.20101.(大家如有需要，可至文末掃碼下載)在我國(guó)，細(xì)胞治療的國(guó)家主管部門是國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)(NHFPC)和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA),下圖是我國(guó)針對(duì)細(xì)胞治療出臺(tái)的相關(guān)政策法規(guī)：疇圉冢衛(wèi)生計(jì)主叢關(guān)成人的侔細(xì)胞洽療屋基因治抒臨床研兗廣控熨點(diǎn)或人爲(wèi)因治疔申報(bào)臨庸試驗(yàn)指導(dǎo)原則釁E齣治療產(chǎn)品硏究導(dǎo)評(píng)階技術(shù)抬導(dǎo)虛則試行）$C按新

11、菊進(jìn)行餐理）去于即發(fā)干細(xì)胸臨味研究笆理辦法疇圉冢衛(wèi)生計(jì)主叢關(guān)成人的侔細(xì)胞洽療屋基因治抒臨床研兗廣控熨點(diǎn)或人爲(wèi)因治疔申報(bào)臨庸試驗(yàn)指導(dǎo)原則釁E齣治療產(chǎn)品硏究導(dǎo)評(píng)階技術(shù)抬導(dǎo)虛則試行）$C按新菊進(jìn)行餐理）去于即發(fā)干細(xì)胸臨味研究笆理辦法（試行的說(shuō)知瓦人體細(xì)胞泊療硏究和制刑質(zhì)盂控制技術(shù)的拒導(dǎo)于取消第三裘醫(yī)療技術(shù)臨庫(kù)引用準(zhǔn)入審批有關(guān)工作的通知陥醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法橙苜批處許臨床應(yīng)用的第三董醫(yī)療技術(shù)冃錄31993.51994.1003.3SOfl.a2009.52009.62012015.73.015.81017.12自仲免疫姻腕CT如胞NK細(xì)腿泊抒技術(shù)萱岬規(guī)范（征求意見(jiàn)稿戀干細(xì)胞臨床詡究背理為法矗和瓦干

12、細(xì)胸制割質(zhì)工控制21臨康前研究扌旨導(dǎo)原則試f亍】以下以CTL019為例來(lái)分析細(xì)胞治療質(zhì)量控制策略，目前細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制分為四個(gè)大的方面，分別為安全性（Safety）,純度（Purity）,潛能性（Potency）以及均一性（Identity）,這些質(zhì)量控制會(huì)貫穿CAR-T生產(chǎn)的不同階段，下圖列舉了這些檢測(cè)會(huì)在不同的階段開(kāi)展。MaslefCell曲k(MCB)0EI9BQ陽(yáng)撫旳CtilBank(WCB)VjrvsBanlt(MVBiWVBJ即呷FrchductSBMaslefCell曲k(MCB)0EI9BQ陽(yáng)撫旳CtilBank(WCB)VjrvsBanlt(MVBiWVBJ即呷Frch

13、ductSB翁BioRcliancetrAKF【:drntilytreogtfnkj2F在T細(xì)魄表直表遲莖（2F在T細(xì)魄表直表遲莖（FACS）匚即轉(zhuǎn)染聶率血呻水平（：|PCR）細(xì)胞社（全自功細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）毎干克棒歪6R裁T整胞刊毎計(jì)算邀圍活率CD45KD3+-(FACS)匚UR在表這苣(:AC5)CRE轉(zhuǎn)M室EFINA亦平(qPFR)殊余BSAjftM(EH5A)雀余殖珠檢則雀余(CD45tCD3-CD15tj揃測(cè)(FACEr1Safety1IkJ無(wú)廂.円竜素r壹原體忙刪犠叱據(jù)圮界栓詛-衆(zhòng)寶且耗旳:心刪甌岀亂期ai”FQA軒求1LJ輕霍訪醴1E細(xì)挪俶大卜活率-細(xì)胞佛鑒屋（Z絡(luò)胞因子釋放和反應(yīng)性再

14、劇城細(xì)胞生衣速軽測(cè)試肉余磯珠檢測(cè)對(duì)機(jī)為表迖的吧機(jī)細(xì)胞功橄測(cè)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用于質(zhì)量分析帶來(lái)的挑戰(zhàn)在這些實(shí)驗(yàn)中，大部分是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)因?yàn)椴僮鞣椒?，樣本差異等因素?huì)給結(jié)果帶來(lái)較大的波動(dòng)，也給這些方法向GMP轉(zhuǎn)移帶來(lái)了挑戰(zhàn)，同時(shí)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范難以制定，以CAR-T的轉(zhuǎn)染效率測(cè)定為例，不同的人對(duì)流式細(xì)胞儀結(jié)果設(shè)門得到的差異會(huì)有較大的差異。細(xì)胞治療質(zhì)量控制的基石實(shí)驗(yàn)-濃度，活率細(xì)胞濃度活率測(cè)試方面，其是很多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，比如細(xì)胞生長(zhǎng)速率測(cè)定，細(xì)胞因子檢測(cè)，細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)檢測(cè)方面，細(xì)胞計(jì)數(shù)是這些實(shí)驗(yàn)的第一步，這一步如果錯(cuò)誤，那么結(jié)果波動(dòng)大是預(yù)料之中的。另外在在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，極為重要

15、的一點(diǎn)是優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件。細(xì)胞的濃度，活率，結(jié)團(tuán)率，形態(tài)是了解反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)?？偠灾?，CAR-T從細(xì)胞收集開(kāi)始到最后的產(chǎn)品回輸，濃度活率一直是最關(guān)鍵的指標(biāo)之一。既然濃度活率對(duì)于CAR-T整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程這么的重要，小編自作主張的調(diào)研和試用了市場(chǎng)上最暢銷的幾款細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，尤其衷愛(ài)我國(guó)自主研發(fā)生產(chǎn)的CountstarRigel熒光細(xì)胞分析儀。不得不說(shuō)，這款產(chǎn)品的智能、精準(zhǔn)、合規(guī)滿足了小編對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀所有的想象。智能作為新時(shí)代年輕人，觸屏的使用已經(jīng)深入人心，這款產(chǎn)品的設(shè)計(jì)也讓小編有告別傳統(tǒng)PC時(shí)代，與科技進(jìn)步共發(fā)展的認(rèn)同感。只需動(dòng)一動(dòng)手指，即可全自動(dòng)獲得細(xì)胞分析結(jié)果和圖像。高質(zhì)量的圖像

16、可通過(guò)多點(diǎn)觸控放大或縮小，讓你看得真切，讓小編對(duì)結(jié)果的真實(shí)性不再懷疑。三分鐘檢測(cè)五個(gè)樣，用這樣的神器，老板再也不用擔(dān)心我的計(jì)數(shù)速度啦。正是這款小小的熒光細(xì)胞分析儀其實(shí)具有大智慧。除細(xì)胞濃度活率檢測(cè)外，對(duì)于CarT細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡等測(cè)試這款儀器也能進(jìn)行很好的分析。-卜I_IFI活率細(xì)庖殺雷細(xì)胞凋亡-卜I_IFI活率細(xì)庖殺雷細(xì)胞凋亡CD袖前止吩析精準(zhǔn)小編親測(cè)，使用AOPI活率檢測(cè)程序測(cè)試細(xì)胞濃度和活率，看一遍即會(huì)使用，5槽測(cè)試結(jié)果CV0.99,多臺(tái)儀器間測(cè)試結(jié)果一致。多個(gè)地區(qū)，多類樣品,多個(gè)人開(kāi)展測(cè)試，也不再擔(dān)心數(shù)據(jù)的一致性。8.00E+067.00E+066.00E+060.9955

17、i.OOE+OS4.OOE+DB3.OOE+D62.00E+061.00E+Q6O.OOE+OO0.48.00E+067.00E+066.00E+060.9955i.OOE+OS4.OOE+DB3.OOE+D62.00E+061.00E+Q6O.OOE+OO0.41.72E+06CountstarRigel的AOPI細(xì)胞活率測(cè)試，可用于全血的質(zhì)量評(píng)估，PBMC分離效率檢測(cè)，T細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)，T細(xì)胞的增殖率和活率，產(chǎn)品釋放質(zhì)量控制，在CarT細(xì)胞治療整個(gè)質(zhì)量控制過(guò)程均可使用細(xì)瞌擴(kuò)增壤曲憐飾收廉坦帕SPBMC6治療整個(gè)質(zhì)量控制過(guò)程均可使用細(xì)瞌擴(kuò)增壤曲憐飾收廉坦帕SPBMC6合規(guī)從美國(guó)藥典，F(xiàn)DA以及CFDA的法規(guī)來(lái)看，對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品用于藥品，符合GMP規(guī)范進(jìn)行管理成為未來(lái)的趨勢(shì)。所以，小編對(duì)儀器最重要最基本的要求就是需要符合GMP/cGMP、數(shù)據(jù)審計(jì)追蹤、FDA21CFRPART11。CountstarRigel從設(shè)計(jì)到服務(wù)完全符合這個(gè)要求！同時(shí)，CountstarRigel提供標(biāo)準(zhǔn)微珠顆粒、3Q驗(yàn)證服