生物化學(xué)試驗(yàn)報(bào)告

1、v1.0可編輯可修改實(shí)驗(yàn)一糖類的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（一）糖類的顏色反應(yīng)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解糖類某些顏色反應(yīng)的原理。2、學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類的方法。二、顏色反應(yīng)（一）a -蔡酚反應(yīng)1、原理糖在濃無機(jī)酸（硫酸、鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能與a -蔡酚生成紫紅色物質(zhì)。因?yàn)榭啡┘翱啡┭苌飳Υ朔磻?yīng)均呈陽性， 故此反應(yīng)不是糖類的特異反應(yīng)。2、器材試管及試管架，滴管3、試劑莫氏試劑：5% a -蔡酚的酒精溶液1500mL稱取a -蔡酚5g,溶于95%酒精 中，總體積達(dá)100 mL,貯于棕色瓶內(nèi)。用前配制。1 %葡萄糖溶液100 mL1 %果糖溶液100 mL1 %蔗糖溶液100 mL1

2、 %淀粉溶液100 mL%糠醛溶液100 mL濃硫酸500 mL4、實(shí)驗(yàn)操作取5支試管，分別加入1 %葡萄糖溶液、1 %果糖溶液、1 %蔗糖溶液、1%淀 粉溶液、糠醛溶液各1 mL再向5支試管中各加入2滴莫氏試劑，充分混 合。傾斜試管，小心地沿試管壁加入濃硫酸1 mL慢慢立起試管，切勿搖動(dòng)。觀察記錄各管顏色。（二） 間苯二酚反應(yīng)v1.0可編輯可修改1、原理在酸作用下，酮醵脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚作用生成紅色物 質(zhì)。此反應(yīng)是酮醵的特異反應(yīng)。醛糖在同樣條件下呈色反應(yīng)緩慢， 只有在糖濃度 較高或煮沸時(shí)間較長時(shí)，才呈微弱的陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)條件下蔗醒有可能水解而呈 陽性反應(yīng)。2、器材試管及試管

3、架，滴管3、試劑塞氏試劑：間苯二酚鹽酸溶液 1000 mL稱取間苯二酚0.05 g溶于30 mL 濃鹽酸中，再用蒸儲(chǔ)水稀至1000 mL。1 %葡萄糖溶液100 mL1 %果糖溶液100 mL1 %蔗糖溶液100 mL4、實(shí)驗(yàn)操作取3試管，分別加入1 %葡萄糖溶液、1 %果糖溶液、1 %蔗糖溶液各mL。再向3支試管中各加入塞氏試劑5mL充分混合。將試管同時(shí)放入沸水浴中，。 觀察記錄各管顏色。）糖類的還原作用、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、理解并掌握糖類的還原性質(zhì);2、學(xué)習(xí)常用的鑒定糖類還原性的方法。3、了解斐林氏、本尼迪克特試法檢驗(yàn)糖的原理還原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的單糖和某些二糖（如乳

4、糖和麥芽糖）。在堿性溶液中，還原糖能將 Cu2+ Hg2+Fe3+、Ag舟金v1.0可編輯可修改屬離子還原，而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類的這種性質(zhì)常被用于糖的 定性和定量測定。三、器材試管及試管架，水浴鍋電爐四、試劑1斐林試劑甲液氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/mL的溶液。乙液硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05 g/mL的溶液。2本尼迪克特試劑3 1 %葡萄糖溶液100 mL4 1 %果糖溶液100 mL5、1 %蔗糖溶液100 mL五實(shí)驗(yàn)操作六思考題1、斐林氏、本尼迪克特試法檢驗(yàn)糖的原理是什么2、試比較斐林氏、本尼迪克特試法的方法。v1.0可編輯可修改實(shí)驗(yàn)二總糖的測定-電:酮比色法一、實(shí)驗(yàn)

5、目的掌握慈酮法測定可溶性糖含量的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理強(qiáng)酸可使糖類脫水生成糠醛，生成的糠醛或羥甲基糖醛與慈酮脫水縮合， 形 成糠醛的衍生物，呈藍(lán)綠色，該物質(zhì)在 620nm處有最大吸收。在10-100ug范圍 內(nèi)其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。這一方法有很高的靈敏度，糖含量在 30ug左右就能進(jìn)行測定，所以可做為微量測糖之用。一般樣品少的情況下，采 用這一方法比較合適。三、儀器、試劑和材料1 .儀器(1)分光光度計(jì)(2)電子頂載天平(3)三角瓶：50m1 X 1大試管：9支(5)試管架，試管夾(6)漏斗，漏斗架(7)容量瓶：50 m1 X 2(8)刻度吸管：1m1X3 , 2m1X1 , 5

6、mlX1水浴鍋.試齊1J葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：l00ug/ml濃硫酸(3)慈酮試劑：意酮溶于100ml濃H2SO中當(dāng)日配制使用。.材料v1.0可編輯可修改小麥分英節(jié)（或者其它材料）四、操作步驟.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支大試管，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液:管號(hào)1234567葡錮糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml ）0蒸儲(chǔ)水（ml ）1葡錮糖含量（ug ）0102030406080在每支試管中立即加入慈酮試劑 ，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一 起浸于沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸 l0min取出，用流水冷卻，室溫放置 10min ,在620 nm波長下比色。以標(biāo)準(zhǔn) 葡萄糖含

7、量（ug）作橫坐標(biāo)，以吸光值作縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。.植物樣品中可溶性糖的提取將小麥分奠節(jié)剪碎至2mm以下，準(zhǔn)確稱取1g,放入50m1三角瓶中，加沸 水25m1,在水浴中加蓋煮沸10min ,冷卻后過濾，濾液收集在50m1容量瓶中, 定容至刻度。吸取提取液2m1 ,置另一 50m1容量瓶中，以蒸儲(chǔ)水稀釋定容，搖 勻測定。.測定吸取lml已稀釋的提取液于大試管中，加入慈酮試劑，以下操作同標(biāo)準(zhǔn) 曲線制作。比色波長620nm，記錄吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖的含量（ug）, 查表所得糖含量（ug） x稀釋倍數(shù)五、結(jié)果處理六、注意事項(xiàng)1該顯色反應(yīng)非常靈敏，溶液中切勿混入紙屑及塵埃。2 H 2 SQ要

8、用高純度的。v1.0可編輯可修改3不同糖類與慈酮的顯色有差異，穩(wěn)定性也不同。加熱、比色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格掌握七、思考題1意酮比色測定糖的原理是什么2用水提取的糖類有哪些3制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)注意哪些事項(xiàng)4分光光度計(jì)的原理是什么使用時(shí)需要注意哪些v1.0可編輯可修改實(shí)驗(yàn)三粗脂肪的提取和定量測定一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪提取的原理和測定方法。.熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括樣品的處理、定量轉(zhuǎn)移、烘干、包 重等。二實(shí)驗(yàn)原理本法為重量法，用脂肪溶劑將脂肪提出后進(jìn)行稱量。 該法適用于固體和液體 樣品，通常將樣品浸于脂肪溶劑，如乙醴或沸點(diǎn)為30-60度的石油醴，借助于索 氏提取管進(jìn)行循環(huán)抽提。本法提取的脂溶

9、性物質(zhì)為脂肪類似物的混合物，其中含有脂肪，游離脂肪酸，磷脂，酯，固醇，芳香油，某些色素及有機(jī)酸等，因此， 稱為粗脂肪。用該法測定樣品含油量時(shí)，通常采用沸點(diǎn)低于 60度的有機(jī)溶劑，此時(shí)，樣 品中結(jié)合狀態(tài)的脂類（脂蛋白）不能直接提取出來，所以該法又稱為游離脂類定 量測定法。三儀器、試劑和材料.儀器索式提取器，分析天平，燒杯，烘箱，干燥器，恒溫水浴，脫脂棉，脫脂濾紙，銀子2試劑和材料石油醴芝麻或者花生等油料種子。四、實(shí)驗(yàn)步驟.樣品的準(zhǔn)備將花生在80度烘箱內(nèi)烘去水分，烘干時(shí)需避免過熱，冷卻后準(zhǔn)確地稱取 1 克左右放入研缽中研碎，再用濾紙將樣品包裹好放入索氏提取管內(nèi)。 注意勿使紙 包內(nèi)樣品高于提取管的虹

10、吸部分，研磨后的研缽應(yīng)用濾紙擦凈并將濾紙放入提取v1.0可編輯可修改管內(nèi)，用少量溶劑洗滌研缽，將溶劑倒入提取管中.抽提洗凈提取瓶于105度烘干至恒重，記下其重量。裝入石油醴達(dá)提取瓶容積的一半, 連接提取器各部分，不能漏氣（不能用凡士林或真空脂）。加熱提?。菏故王访啃r(shí)循環(huán) 10-20次，約小時(shí)，用濾紙粗略判斷脂肪是否 提取完全。蒸去石油醴，烘干至恒重。.稱量計(jì)算粗脂肪省旨肪重+牛品重x 100%思考題1、索式提取法提取的為什么是粗脂肪2、做好本試驗(yàn)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)3、本實(shí)驗(yàn)裝置磨口處為什么不能涂抹凡士林或真空脂v1.0可編輯可修改實(shí)驗(yàn)四總氮量的測定一一凱氏定氮法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)微量凱氏定氮

11、法的原理2、掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括標(biāo)準(zhǔn)硫酸俊含量的測定，未知樣品的消化、蒸儲(chǔ)、滴定及其含氮量的計(jì)算等。二、實(shí)驗(yàn)原理凱氏定氮法常用于測定天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)，核酸及氮基酸等）的含氮量。天然的含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸俊。此時(shí)程稱之為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。濃堿可使消化液中的硫酸俊分解，游離出氮，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸儲(chǔ)到一定量，一定濃度白硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成俊離子， 使溶液

12、中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)（相當(dāng)于待測物中氨的當(dāng)量數(shù)） 計(jì)算出待測物中的氮量。滴定時(shí)用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為，將NHHBO的藍(lán)色滴至原來HBO的藍(lán)紫色即為終點(diǎn)。本法適用范圍毫克氮。相對誤差應(yīng)小于 2%三、材料、試劑與器具（一）材料人的血清或豬的血清（二）試劑1、濃硫酸（化學(xué)純）2、30%8氧化鈉（分析純）溶液v1.0可編輯可修改3、NaC溶液4、硫酸鉀一硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅（CuSG 5HO）以3: 1 （W/W 的配比混合研磨成粉末。5、2%1酸6、混合指示劑的配制：方法一：取50毫升%3烯藍(lán)無

13、水醇溶液與200毫升%3基紅無水乙醇溶液混 合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時(shí)為紫色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍 窄且靈敏。方法二： 哪甲酚綠乙醇溶液10毫升與%基紅乙醇溶液2毫升混和即成。本指示劑的變色范圍為紫紅色 灰色 綠色. HCl.硼酸一指示劑混合液：取100毫升2%1酸溶液，滴加混合指示劑貯備液,搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可。（約加1毫升左右混合指示劑）9.標(biāo)準(zhǔn)硫酸俊溶液（毫克氮/毫升）（三）、器具凱氏燒瓶消化架吸量管（1毫升、2毫升）量筒（10毫升）凱氏定氮蒸儲(chǔ)裝置微量滴定管（3毫升、5毫升，可讀至毫升）錐形瓶（50-100毫升）容量瓶（50毫升） 四、操作步驟（一）樣品的處理10v

14、1.0可編輯可修改血清樣品：取人血（或豬血），放于離心管中，于冰箱中放置過液，次日離 心除去凝血塊，上層黃色透明清液即為血清。準(zhǔn)確吸取血清毫升加入NaCl毫升， 仔細(xì)混勻備用。固體樣品：某一固體樣品中的含氮量是100克該物質(zhì)（干重中所含氮的克數(shù)） 來表示（%。因此在定氮前，應(yīng)將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫 度都采用105C,因?yàn)榉怯坞x的水都不能在100c以下烘干。在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，然后置 105c的烘箱內(nèi)干燥4小時(shí)。 用地竭將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。 每干燥1小時(shí)后，稱量一次，直到兩次稱量的數(shù)量不變，即達(dá)恒重。（二）消化取2個(gè)50

15、毫升的凱氏燒瓶，向第一號(hào)燒瓶內(nèi)加 2毫升稀釋血清溶液（或4 毫升核酸制品溶液，或200毫克固體粉末）。注意，用吸量管直接將溶液（或用 試管加入固體樣品）加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上，向2號(hào)燒瓶加入2毫升水作空白對照。在每個(gè)燒瓶內(nèi)加入硫酸鉀一硫酸銅混合物約 0.2克，濃硫酸3毫升，小瓷片 兩粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個(gè)瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚 內(nèi)的電爐上消化。在消化開始時(shí)，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸 開始分解并放出SO白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色 為止。消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸儲(chǔ)水10毫升（注意慢加，邊加邊搖）。冷

16、卻后將瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)入50毫升的容量瓶中，并用蒸儲(chǔ)水洗燒瓶數(shù)次，溶液 一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號(hào)備用。（三）蒸儲(chǔ)1、儀器的洗滌：儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。蒸儲(chǔ)器有幾種，應(yīng)用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：開放自來水龍頭，使水 E進(jìn)入G,從K管流出（水不宜開得過大以免水從 G 管溢出）。開放P3,使水進(jìn)入A室，漏斗D中加蒸儲(chǔ)水約10毫升入B室。用拇指11v1.0可編輯可修改將管口按緊，同時(shí)開放R,則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K 管流出，一般情況下如此重復(fù)洗滌兩次即可。若蒸儲(chǔ)器內(nèi)有氨存在，則應(yīng)加入蒸 儲(chǔ)水后，不加樣品蒸儲(chǔ)一次方可使用。（可用PH試紙檢查。）

17、A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開關(guān)，Pi為出水開關(guān)，B為蒸儲(chǔ)室，與出氣室M相遇， M管插入盛有定量酸液的錐形瓶，B室內(nèi)有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng) P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入 B室，F(xiàn)為指形冷凝管，E為進(jìn)水管， 水經(jīng)F、G K而流出，蒸儲(chǔ)時(shí)B室進(jìn)消化好的樣品及NaOH,二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，B 室經(jīng)M管進(jìn)入錐形瓶中的酸吸收。2、滴定標(biāo)準(zhǔn)樣品先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸俊溶液試驗(yàn)23次。蒸儲(chǔ)器洗凈后，開放水龍頭 P3,使水進(jìn)入 A室，水放至A室球部即可。取3個(gè)50毫升的錐形瓶，各準(zhǔn)確加入10毫升硼酸（內(nèi)加有混合指示劑）。 用表面皿覆蓋備用。加樣：用吸管吸取1毫升標(biāo)準(zhǔn)硫酸俊溶液，細(xì)心地由漏斗 D傾入蒸儲(chǔ)室

18、，再 用蒸儲(chǔ)水1毫升清洗漏斗。取一個(gè)盛有硼酸一混合指示劑的錐形瓶，置于M管下， 使管口恰好接觸硼酸溶液，用量筒從漏斗 D加入30瓶氧化鈉8毫升，隨即將R 火緊，并往漏斗加入少量蒸儲(chǔ)水封閉。蒸儲(chǔ)：用酒精燈加熱（應(yīng)用擋風(fēng)板將燈圍攏，維持火力恒定，沸騰不可高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸，待第一滴蒸儲(chǔ)液從冷凝柱 F頂端滴下時(shí)起，繼 續(xù)蒸儲(chǔ)5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸2分鐘，最后用蒸儲(chǔ)水 洗導(dǎo)管外壁，蒸儲(chǔ)完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸儲(chǔ)器洗凈。）3、樣品及空白蒸儲(chǔ)：用吸量管分別吸取 1毫升樣品和1毫升蒸儲(chǔ)水按上述 操作步驟進(jìn)行蒸儲(chǔ)。4、滴定：蒸儲(chǔ)完畢，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定錐瓶內(nèi)溶液至淡紫色或

19、灰色，記 錄所用鹽酸的量。（四）計(jì)算若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要更復(fù)12v1.0可編輯可修改雜一些。首先需向樣品中加入三氯乙酸，使其最終濃度為5%然后測定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后的樣品的上清液中的含氮量，從而計(jì)算出蛋白氮，再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)的含量。蛋白氮=總氮一非蛋白氮蛋白質(zhì)含量（克/%）=蛋白氮X五、注意事項(xiàng)1、凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，可用于動(dòng)植物的各種組織，器官及食品等 成組復(fù)雜樣品的測定，只要細(xì)心操作都能得到精確的結(jié)果。其缺點(diǎn)是操作比較復(fù) 雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測定結(jié)果偏高。2、普通實(shí)驗(yàn)室中的空氣中常含有少量的氨，會(huì)影響結(jié)果，所以操作

20、應(yīng)在單 獨(dú)潔凈的房間中進(jìn)行，并盡可能快地對硼酸吸收液進(jìn)行滴定。七、思考題1、正式測定未知樣品前為什么必須測定標(biāo)準(zhǔn)硫酸俊的含氮量及空白2、寫出以下各步的化學(xué)反應(yīng)式：蛋白質(zhì)消化氨的蒸儲(chǔ)氨的滴定3.指出本測定方法產(chǎn)生的誤差的原因。13v1.0可編輯可修改實(shí)驗(yàn)五氨基酸分離鑒定一一紙層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理和操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析是以濾紙作支持物，用一定的溶劑系統(tǒng)展開，使混合樣品達(dá)到分離分 析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中， 點(diǎn)樣在濾紙的一端；再 選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)，從點(diǎn)樣的一端通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當(dāng)?shù)娘@色

21、劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經(jīng) 展開后其一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用比移值 R來表示。紙層析可看作是溶質(zhì)(樣品)在固定相與流動(dòng)相之間的連續(xù)抽提，由于溶質(zhì) 在兩相之間的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離。一定的物質(zhì)在兩相間有固定的分配系 數(shù),因而在恒定條件(液劑、PH溫度)下，各物質(zhì)有固定的 R值，據(jù)此可達(dá) 到分析鑒定的目的。由于濾紙纖維可吸收2025%勺水分；且其中67%；氫鍵形式與纖維素上 羥基結(jié)合，一般條件下難脫去；所以紙層析實(shí)際上是以水相作固定相， 展開的溶 劑作流動(dòng)相。紙層析操作按溶劑展開方向可分為上行、下行和徑向三種。氨基酸分離一般 用上行法。上行法又分單向(成分較為簡單的樣品)和雙向(

22、單向時(shí)斑點(diǎn)重疊分 離不開，于是在其垂直方向用另一種溶劑系統(tǒng)展層)。雙相層析譜可分辨十幾種 以上的樣品。層析濾紙要求：(1)質(zhì)地均勻，平整無折痕，厚薄適當(dāng)，溶劑能勻速展開。(2)機(jī)械強(qiáng)度好，溶劑展開后能保持原狀，不易折到。(3)有一定純度而少雜質(zhì)，以免影響層析圖譜背景。(4)纖維松緊適宜，一般選用中速濾紙，或根據(jù)溶劑選擇。如丁醇類粘度大，14v1.0可編輯可修改宜用快速濾紙；而氯仿、石油醴展開快，宜用慢速濾紙。層析溶劑要求：(1)被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中R在之間，各組分之R值相差最好能大 于，以免斑點(diǎn)重疊。(2)溶劑系統(tǒng)中任一組分與分離物之間不能起化學(xué)反應(yīng)。(3)分離物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的分配較恒定

23、，不隨溫度而變化，且易迅速達(dá)到平衡，這樣所得斑點(diǎn)較圓整。本實(shí)驗(yàn)采用八種混合氨基酸為樣品，用酸性和堿性兩種溶劑進(jìn)行雙向?qū)游觯?以西三酮為顯色劑，可獲得分離清晰的層析圖譜。三、試劑和器材1、試劑% (WM西三酮溶丙酮液。溶劑系統(tǒng)：第一相：正丁醇：88刈酸：水=15 ： 3 ： 2 (V/V)；第二相：正丁醇：叱噬：95叱醇：水=5 ： 1 ： 1 ： 1 (VZV)o2、測試樣品標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合溶液：亮氨酸、繳氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、組氨酸、絲氨酸各 100mg溶于50ml 0.01M鹽酸中。3、器材層析缸25X 40cm ( X2);培養(yǎng)皿15cm ( X 2);噴霧器；毛細(xì)管

24、內(nèi)徑0.1cm； 電吹風(fēng)；烘箱。層析濾紙14X 11cm鉛筆，尺。四、操作方法1、點(diǎn)樣取層析濾紙一張(14x 11cm,在距紙邊1.2cm處劃一基線；再將紙轉(zhuǎn)90 , 距紙邊1.2cm處作一線與上線垂直。以毛細(xì)管吸取混合氨基酸溶液，點(diǎn)與二線交 點(diǎn)處，點(diǎn)的直徑控制在2mm右，不可過大。待樣品干燥后再點(diǎn)一次。濾紙上點(diǎn) 樣斑點(diǎn)干燥后，把濾紙卷成圓筒形，紙的兩邊以銘絲相連，但不可重疊相碰。2、展層15v1.0可編輯可修改在層析缸中平穩(wěn)的放入裝有第一相層析溶劑的培養(yǎng)皿。將圓筒形濾紙放入， 點(diǎn)樣一段接觸溶劑，以點(diǎn)樣處不浸入溶劑為準(zhǔn)。待溶劑自下而上均勻展開，約 2 小時(shí)后溶劑到達(dá)距紙邊0.5cm處取出濾紙，

25、懸掛于室溫中，以電吹風(fēng)充分吹盡溶 劑。然后裁去未走過溶劑的濾紙邊緣，將濾紙轉(zhuǎn)90。，卷成如前圓筒狀，放入盛第二相溶劑的層析缸內(nèi)展開(操作同上)，約1小時(shí)后溶劑展開到距紙邊時(shí)取 出，以電吹風(fēng)吹盡溶劑使其干燥。3、顯色以噴霧器將西三酮均勻地噴在濾紙上， 然后懸濾紙于65c烘箱內(nèi)加熱20分 鐘，即可看到紫紅色氨基酸斑點(diǎn)，將圖譜上的斑點(diǎn)用鉛筆圈出。五、注意事項(xiàng)(1)烘箱加熱溫度不可過高，且不可有氨的干擾，否則圖譜背景會(huì)泛紅。(2)第一相溶劑最好在使用前再按比例混合， 否則會(huì)引起酯化影響層析效果。(3)接觸濾紙時(shí)，要戴手套。六、思考題：1、什么叫紙層析法2、何謂R值影響R值的主要因素是什么3、怎樣制備擴(kuò)

26、展劑4、層析缸中平衡溶劑的作用是什么5、酸性與堿性溶劑系統(tǒng)對氨基酸極性基團(tuán)的解離各有何影響16v1.0可編輯可修改實(shí)驗(yàn)六蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(一)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。.了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。.學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法二、呈色反應(yīng)：(一)雙縮月尿反應(yīng)：.原理：尿素加熱至180c左右生成雙縮月尿并放出一分子氨。 雙縮月尿在堿性環(huán)境中能 與cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮月尿反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵， 其結(jié)構(gòu)與雙縮月尿相似，也能發(fā)生此反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽部有雙縮月

27、尿反應(yīng)， 但有雙縮月尿反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。.試齊J:(1)尿素： 10 克(2)10%氫氧化鈉溶液250 毫升17v1.0可編輯可修改(3)1%硫酸銅溶液 60 毫升(4)2 %卵清蛋白溶液 80 毫升.操作方法：取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開 始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮月尿。冷后，加 10%氫氧化鈉溶液 約1毫升，振蕩混勻，再加1 %硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。 避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約l毫升和10%氫氧化鈉溶液約2毫升，搖勻, 再加1%硫酸銅溶液2滴，

28、隨加隨搖，觀察紫玫色的出現(xiàn)。(二)西三酮反應(yīng)1.原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和西三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外， 所有a 氨基酸及一切 蛋白質(zhì)都能和西三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1: 1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一 種常用的氨基酸定量測定方法。西三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO、NH和醛，水合苗三酮被還原成還原型西三酮；第二步是所形成的還原型西三酮同另一個(gè)水合苗三 酮分于和氨縮合生成有色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下：OohIIo任原折三國18v1.0可編輯可修改十/c=orc CHO十/c=orc CHO此反應(yīng)的適宜pH為57,同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件

29、下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。2.試齊J:(1)蛋白質(zhì)溶液 100 毫升%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液(蛋清：水=1: 9)%甘氨酸溶液 80毫升%西三酮水溶液 50 毫升%苗三酮一乙醇溶液20 毫升3.操作方法：(1)取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液 1毫升，再各加毫升西 三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱 1 2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變 藍(lán)。(2)在一小塊濾紙上滴一滴%的甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴上一滴%的西三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。(三)黃色反應(yīng)：.原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該 化合物在堿性

30、溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝釀酸鈉。反應(yīng)式如下：19v1.0可編輯可修改HO- v1.0可編輯可修改HO- +明即一N-。，的多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化, 需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。.試齊J:(1)雞蛋清溶液 100 毫升將新鮮雞蛋的蛋清與水按1: 20混勻，然后用六層紗布過濾。(2)大豆提取液 100毫升將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀用紗布過濾。(3)頭發(fā)(4)指甲%苯酚溶液50毫升(6)濃硝酸200毫升%色氨酸溶液10毫升%酪氨酸溶液10毫升(9)10 %氫氧化鈉溶液100毫升3.操作方法：向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試

31、管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。20v1.0可編輯可修改管號(hào)JZ315:A -V F 1?杭科鳩慨精 淀悵*土豆 提票被指甲少許具發(fā)沙將CL5喝 笨酣444法第釀（楠）*4。4044A現(xiàn)象 （四）乙醛酸反應(yīng).原理：在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì) ，反應(yīng)機(jī)理尚不清楚, 可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng).試齊IJ: 蛋白質(zhì)溶液100毫升雞蛋清：水=1: 20%色氨酸溶液10毫升冰醋酸200毫升（4）濃硫酸（分析純）100毫升.操作方法：制答號(hào)水W，。方色

32、氨第 港覆（蒂）宣白質(zhì)落薇冰屋栽 毒升）曳 ft1&一1 i24111a52121v1.0可編輯可修改取3支試管。編號(hào)。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸溶液和水，然后 各加入冰醋酸2毫升?；靹蚝髢A斜試試管，沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約I毫升, 靜置。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯，可于水浴中微熱實(shí)驗(yàn)(二)蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定：.目的：了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。(2)學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法.原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：XOOH 、N弭 家白質(zhì)步手 f COO- , .COO- “ /COOH p /J* - p /- - p /、Nm i

33、QH NH* 、NH；網(wǎng)離子兼修離子、川離了+ pHpIpH=plpHpI電毋中；移向陽橇不售油彈向陰區(qū)蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)日相等， 在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極 移動(dòng)，也不向陽極移動(dòng)，此時(shí)溶液的 pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白 質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種 性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測其溶解度最低時(shí)的溶液 pH值。本實(shí)驗(yàn)借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與 酷酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液

34、。向諸緩沖 溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。.器材:22v1.0v1.0可編輯可修改水浴鍋。溫度計(jì)。(3)200毫升錐形瓶 (4)100毫升容量瓶 (5)吸管。(6)試管。試管架。(8)乳缽。.試劑：(1) %酪蛋白醋酸鈉溶液 200 毫升取0.4克酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細(xì)地研 6,將所得的蛋白質(zhì)懸波移入 200毫升錐形瓶內(nèi)，用少量4050c的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內(nèi)加入10毫升1當(dāng)量/升醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到 50c水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶液全部移至100毫升容量瓶 內(nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻

35、(2)當(dāng)量/升醋酸溶液100毫升(3)當(dāng)量/升醋酸溶液100毫升(4)當(dāng)量/升醋酸溶液50毫升5.操作方法：(1)取同樣規(guī)格的試營4(1)取同樣規(guī)格的試營父管號(hào)OE1當(dāng)段F升附皎1彳升)傳升、_ _18.4_ _i 一a人8.00.310乜-11.47- ,-(2)向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1毫升，加一管，搖句一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH值依次為、。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其23v1.0可編輯可修改混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。二、蛋白廈的沉淀及變性：.目的：加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。.原理：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)穎拉可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。(1)可逆的沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì) 的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì) 的鹽析作用或在低溫下用乙醇(或丙酮)短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常 利用此類反應(yīng)。(2)不可逆沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變， 蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原