《生物化學(xué)》34 DNA的復(fù)制和修復(fù)

1、第十三單元 核酸代謝 第33章 核酸的降解和核苷酸的代謝第34 章 DNA的復(fù)制與修復(fù)第35章 DNA的重組第36章 RNA的合成與加工第34章 DNA的復(fù)制和修復(fù) DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物機(jī)體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過(guò)DNA的復(fù)制由親代傳給子代。在后代的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。本章講述： 一、DNA的復(fù)制 二、DNA的損傷修復(fù) 三、DNA的突變一、DAN的復(fù)制 概述 (一) DNA的半保留復(fù)制 (二) DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式 (三)

2、 DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶 (四) DNA的半不連續(xù)復(fù)制 (五) DNA復(fù)制的拓?fù)湫再|(zhì) (六) DNA復(fù)制的過(guò)程 (七) 真核生物DNA的復(fù)制概述 原核生物每個(gè)細(xì)胞只含有一個(gè)染色體，真核生物每個(gè)細(xì)胞常含有多個(gè)染色體。染色體DNA的復(fù)制與細(xì)胞分裂之間存在著密切的相互聯(lián)系。一旦復(fù)制完成，就可發(fā)動(dòng)細(xì)胞分裂，細(xì)胞分裂結(jié)束后，又可開(kāi)始新的一輪DNA復(fù)制。細(xì)胞內(nèi)存在極為復(fù)雜的系統(tǒng)， 確保DNA復(fù)制的正確進(jìn)行，并糾正可能出現(xiàn)的誤差。本節(jié)講述內(nèi)容主要是：DNA的半保留復(fù)制、復(fù)制的單位、復(fù)制的酶系、復(fù)制的半不連續(xù)性、復(fù)制的拓?fù)鋵W(xué)、復(fù)制的過(guò)程和調(diào)控機(jī)理等。(一)半保留復(fù)制（Semi-conservative） DN

3、A分子的每一條鏈都含有合成它的互補(bǔ)鏈所必需的全部遺傳信息。按照Watson和Crick提出的假設(shè)，DNA復(fù)制時(shí)，首先堿基間氫鍵需破裂并使雙鏈解旋和分開(kāi)，然后每條鏈可作為模板在其上合成新的互補(bǔ)鏈，結(jié)果由一條鏈可以形成互補(bǔ)的兩條鏈，這樣形成的兩個(gè)DNA分子與DNA分子的堿基順序完全一樣。在此復(fù)制過(guò)程中，每個(gè)子代分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制的方式被稱為半保留復(fù)制。 DNA雙螺旋復(fù)制模型 DNA的半保留復(fù)制機(jī)制可以說(shuō)明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，但是這種穩(wěn)定性是相對(duì) 的，DNA在代謝上并不是完全惰性物質(zhì)，在胞外理化因子和生物因子的作用下DNA會(huì)發(fā)生損傷，需要修復(fù)。在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

4、過(guò)程中也會(huì)有損耗，需要進(jìn)行更新，在發(fā)育和分化過(guò)程中，DNA的特定序列會(huì)進(jìn)行修飾、刪除、擴(kuò)增和重排。而在進(jìn)化角度看， DNA更是處在不斷的變異和發(fā)展之中。DNA半保留復(fù)制的證據(jù) 1958年由Matthew Meselson和Franklin Stahl設(shè)計(jì)的利用15N標(biāo)記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復(fù)制。實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程如下： 將大腸桿菌接種在以15NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)12代，從而使所有DNA分子標(biāo)記上15N。15N-DNA分子 比14N-DNA重， CsCl密度梯度離心后，兩種DNA形成位置不同的區(qū)帶。再將15N標(biāo)記大腸桿菌改放在通常的14NH4Cl培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)

5、。得到的第一代的DNA分子是一半含有15N，另一半含有14N的雜合分子。第二代DNA分子將一半是14N-DNA，一半是15N/14N-DNA。若繼續(xù)培養(yǎng)可以看到14N-DNA增多。如圖提取DNA并在氯化銫密度梯度下離心直到平衡(二)DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式 基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicon).每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)(origin),可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)(terminus)。復(fù)制是在起始階段進(jìn)行控制的，一旦復(fù)制開(kāi)始，它將繼續(xù)下去，直到整個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制。 原核生物的染色體和質(zhì)粒，真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子。它們都在一個(gè)固定的起點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制，復(fù)制的方向大

6、多是雙向的(bidiretional)，既形成兩個(gè)復(fù)制叉(replication fork)或生長(zhǎng)點(diǎn)(growing point)。而單向(unidirectional)則形成一個(gè)復(fù)制叉或生長(zhǎng)點(diǎn)。環(huán)狀DNA復(fù)制叉在電鏡下觀察呈眼狀結(jié)構(gòu)形成結(jié)構(gòu)。 原核細(xì)胞DNA復(fù)制只有一個(gè)復(fù)制起始區(qū)，因此它只有一個(gè)復(fù)制子。 真核細(xì)胞的細(xì)胞核DNA復(fù)制具有多個(gè)復(fù)制起始區(qū)，因此它含有多個(gè)復(fù)制子。 真核生物染色體DNA的復(fù)制叉移動(dòng)速度比原核生物慢的多，這是由于真核生物的染色體具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，復(fù)制時(shí)需要解開(kāi)核小體，復(fù)制后又需重新形成核小體。DNA的不同復(fù)制方式如圖所示復(fù)制叉結(jié)構(gòu)復(fù)制眼結(jié)構(gòu)DNA的不同復(fù)制方式直線雙向

7、多起點(diǎn)雙向單向型雙向型DNA的不同復(fù)制方式有兩種特殊的單向復(fù)制方式一種稱為滾動(dòng)環(huán)(rolling circle)式，噬菌體X174以此種方式復(fù)制。一種稱為取代環(huán)(displacement loop)式或D-環(huán)(D-loop).線粒體和葉綠體DNA以此方式復(fù)制。DNA的不同復(fù)制方式+-5 滾動(dòng)環(huán)A蛋白切開(kāi)D環(huán)復(fù)制(三)DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶 1、DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶2、大腸桿菌DNA聚合酶3、DNA連接酶 與DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶包括多種DNA聚合酶和DNA連接酶。1、DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶 DNA聚合酶的全稱為依賴于DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymer

8、ase），它是負(fù)責(zé)催化DNA復(fù)制的最主要的酶。 DNA聚合反應(yīng)可表示如下：dAMPdTMPdCMPdGMPn1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP+DNADNA聚合酶Mg 2+DNA （n1+n2 + n3 + n4）PPi+ （模板） DNA聚合酶催化的反應(yīng)是按照模板的指令進(jìn)行的，只有當(dāng)進(jìn)入的堿基能與模板鏈的堿基配對(duì)，才能在該酶的催化下形成磷酸二酯鍵。因此，DNA聚合酶是一種模板指導(dǎo)的酶。 加入各種不同生物來(lái)源的DNA作模板，可以同樣引起和促進(jìn)新的DNA的酶促合成，而產(chǎn)物DNA的性質(zhì)完全不取決于聚合酶的來(lái)源，也與四種核苷酸前體的比例無(wú)關(guān)，僅取決于所加入的模板DNA。而且模板DNA的兩

9、條鏈都進(jìn)行復(fù)制。如圖DNA聚合酶催化的鏈延長(zhǎng)反應(yīng) 在DNA聚合酶反應(yīng)中，加入DNA同時(shí)起兩者作用：一條鏈作為引物，另一條鏈作為模板。 (P413)535核苷酸加入到引物3末端配對(duì)堿基模板鏈引物鏈3鏈的合成方向 DNA酶促合成的引物鏈和模板鏈 DNA的體外酶促合成時(shí)，常受到機(jī)械切力或酶切，顯露出的3羥基末端可作為引物鏈。綜上所述，DNA聚合酶的反應(yīng)特點(diǎn)為： 以四種脫氧核糖核苷三磷酸作底物 反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo) 反應(yīng)需要引物3-羥基的存在 DNA鏈的生長(zhǎng)方向?yàn)?3 產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同2、大腸桿菌的DNA聚合酶 在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少5種DNA聚合酶，分別是DNA聚合酶I、II、III

10、，IV和V。其中，DNA聚合酶I發(fā)現(xiàn)得最早（1956年），而聚 合酶IV和V直到1999年才被發(fā)現(xiàn)。 （1） DNA聚合酶I （2） DNA聚合酶II和III （3） DNA聚合酶IV和V（1）DNA聚合酶IKornberg等最初從大腸桿菌中分離出來(lái)的酶稱為DNA聚合酶或Kornber酶。現(xiàn)在人們對(duì)DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)已經(jīng)十分清楚。從大腸桿菌中純化到的DNA聚合酶為單一肽鏈組成，多肽鏈中含有一個(gè)鋅原子。相對(duì)分子質(zhì)量為103,000。當(dāng)有底物和模板存在， DNA聚合酶可使脫氧核糖核苷酸逐個(gè)的加到3 -OH末端的多核苷酸鏈上。它的反應(yīng)也需要引物鏈（DNA鏈或RNA鏈）的存在。37度條件

11、下，每分子DNA聚合酶可催化約1000個(gè)核苷酸的聚合。 DNA聚合酶是一個(gè)多功能酶，它可以催化以下反應(yīng)：通過(guò)核苷酸聚合反應(yīng)，使DNA鏈沿53方向延長(zhǎng)（DNA聚合酶活性）由3端水解DNA鏈（ 35核酸外切酶活性 ） 由5端水解DNA鏈（ 53核酸外切酶活性 ） 由3端使DNA鏈發(fā)生焦磷酸解無(wú)機(jī)焦磷酸鹽與脫氧核糖核苷三磷酸之間的焦磷酸基交換蛋白酶小片段大片段53核酸外切酶35核酸外切酶聚合酶NC圖34-13 DNA聚合酶的酶切片段用蛋白酶有限水解DNA聚合酶，可得以下兩個(gè)片段： DNA聚合酶的35核酸外切酶活性能切除單鏈DNA的 3末端核苷酸，而對(duì)雙鏈DNA不起作用，故不能形成堿基對(duì)的錯(cuò)配核苷酸可

12、被該酶水解下來(lái)，在正常聚合條件下，35核酸外切酶活性不能作用于生長(zhǎng)鏈，如若出現(xiàn)錯(cuò)配堿基，聚合反應(yīng)停止，生長(zhǎng)鏈的3末端核苷酸落入35核酸外切酶位點(diǎn)，錯(cuò)配堿基被除去。因此 DNA聚合酶的35核酸外切酶活性被認(rèn)為起校對(duì)功能。該活性對(duì)DNA復(fù)制的忠實(shí)性極為重要。 DNA聚合酶的53核酸外切酶活性則只作用于DNA的堿基配對(duì)部分，從5末端水解下核苷酸，該酶被認(rèn)為在切除 由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用。DNA半不 連續(xù)合成過(guò)程中岡崎片段的5端引物的切除也依賴于此酶。（2）DNA聚合酶II和III DNA聚合酶發(fā)現(xiàn)后，隨著對(duì)其性質(zhì)的逐步了解，增加了對(duì)該酶是否是細(xì)胞DNA復(fù)制酶的懷疑： 首先，該酶合

13、成DNA的速度太慢 其次，它的持續(xù)合成能力較低 最后，遺傳學(xué)分析表明許多基因突變都會(huì)影響DNA的復(fù)制，但都與DNA聚合酶無(wú)關(guān) 由此表明DNA聚合酶不是復(fù)制酶，而是修復(fù)酶。后來(lái)證明，它在DNA復(fù)制過(guò)程中起著取代RNA引物的作用，只是參與局部修復(fù)。Kornberg T和Gefter在1970年和1971年先后分離出了另外兩種聚合酶，稱為DNA聚合酶和。DNA聚合酶II DNA聚合酶為多亞基酶，活性比DNA聚合酶高，以四種dNTP為底物,從53方向合成DNA，并需要帶有缺口的雙鏈DNA作為模板-引物，反應(yīng)需要Mg 2+ 和NH4+， DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，但無(wú)53外切酶活性，實(shí)驗(yàn)表明D

14、NA聚合酶 也不是復(fù)制酶，也是一種修復(fù)酶。DNA聚合酶 DNA聚合酶是多亞基組成的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在認(rèn)為它是大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)真正負(fù)責(zé)重新合成DNA的復(fù)制酶。現(xiàn)在DNA聚合酶的全酶由10種亞基組成，含有鋅原子。其復(fù)雜的亞基結(jié)構(gòu)使其具有更高的忠實(shí)性，協(xié)同性和持續(xù)性。各亞基的功能互相協(xié)調(diào)，全酶可以持續(xù)完成整個(gè)染色體DNA的合成。 DNA聚合酶I DNA聚合酶II DNA聚合酶結(jié)構(gòu)基因 polA polB polC(dnaE)不同種類(lèi)亞基數(shù) 1 7 10相對(duì)分子量 103000 88000 830000聚合方向 53 53 53 3 -OH引物 需要 需要 需要聚合速度 10002000 2400 15000

15、60000持續(xù)合成能力 3200 1500 50000003 5核酸外切酶 + + +5 3核酸外切酶 + - -功能 切除引物，修復(fù) 修復(fù) 復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶的性質(zhì)比較（3） DNA聚合酶IV和V DNA聚合酶IV和V是1999年才發(fā)現(xiàn)的，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)。當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重的損傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性，因而出現(xiàn)高突變率。3、DNA連接酶（ligase） 該酶催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸基和3-羥基生成磷酸二酯鍵，反應(yīng)需要能量供應(yīng)，大腸桿菌和其他細(xì)菌以NAD為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體則以ATP為能量來(lái)源。GCTAGCTAPPPP33553GCTA

16、GCTAPPPPP355連接酶ATP或NAAMP+PPi或NMN+AMPMg 2+DNA連接的催化反應(yīng)GCTAPPOHP353連接酶ATP或NADMg 2+ NAD NMN+AMP（四）DNA的半不連續(xù)復(fù)制 DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模粭l鏈走向從53，另一條鏈為35。但已知DNA聚合酶的合成方向?yàn)?53，日本學(xué)者岡崎提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuous）的假說(shuō)，認(rèn)為35走向的DNA實(shí)際上是由53方向合成DNA片段連接起來(lái)的。（四）DNA的半不連續(xù)復(fù)制 岡崎認(rèn)為，在復(fù)制叉前進(jìn)之中，一條鏈模板是35走向，DNA 以53方向連續(xù)合成，此鏈被稱為前導(dǎo)鏈（leading

17、 strand）。另一條鏈模板鏈?zhǔn)?3走向，但是與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，隨著復(fù)制叉的移動(dòng)形成許多不連續(xù)的片段，最后連成一條完整的DNA鏈，該鏈稱為滯后鏈（Lagging strand）。滯后鏈合成中形成的小片段被稱為岡崎片段(Okazaki fragment）。另一條鏈模板鏈?zhǔn)?3走向，但是與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，隨著復(fù)制叉的移動(dòng)形成許多不連續(xù)的片段，最后連成一條完整的DNA鏈。 該鏈稱為后隨鏈，滯后鏈（Lagging strand）。滯后鏈合成中形成的小片段被稱為岡崎片段(Okazaki fragment）。 在復(fù)制叉前進(jìn)之中，一條鏈模板是35走向，DNA 以53方向連續(xù)合成，此鏈被稱為前導(dǎo)

18、鏈（leading strand）。 岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制（okazaki 1968年） DNA聚合酶需要引物而RNA聚合酶則不需要，而岡崎片段要以RNA為引物最后又要切除，并以DNA取代是因?yàn)椋?DNA聚合酶具有校正功能，它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次，堿基配對(duì)無(wú)誤后才繼續(xù)往下聚合。RNA聚合酶沒(méi)有校對(duì)功能，因此無(wú)需引物。RNA引物都是從頭新開(kāi)始合成的，它的錯(cuò)配可能性大，在完成引物功能后即將它刪除，而代之以高保真的DNA鏈。 核酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是指核酸分子結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。拓?fù)鋵W(xué)是近代數(shù)學(xué)的一個(gè)分支，它研究曲線和曲面的空間關(guān)系和內(nèi)在數(shù)學(xué)性質(zhì)，而不考慮它們的量度。兩條互相纏繞的雙螺旋核酸分子表

19、現(xiàn)出許多的拓?fù)鋵W(xué)關(guān)系。閉環(huán)DNA的空間關(guān)系如下公式： =+為雙鏈閉環(huán)中兩條鏈的互繞數(shù)或稱為拓?fù)溥B環(huán)數(shù)，雙鏈閉環(huán)的兩條鏈保持連續(xù)時(shí)，其值不變?yōu)镈NA構(gòu)象所應(yīng)有的螺旋數(shù)或扭轉(zhuǎn)數(shù)，只與DNA分子的堿基對(duì)數(shù)目和構(gòu)象有關(guān)為超螺旋數(shù)即纏繞數(shù)（五）DNA復(fù)制的拓?fù)湫再|(zhì) 生物體內(nèi)的DNA分子通常處于負(fù)超螺旋(右手螺旋）狀態(tài)，有利于DNA兩條鏈的解旋。除連環(huán)數(shù)不同外,其他性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體，引起拓?fù)洚悩?gòu)反應(yīng)的酶稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶(topisomerase)。分為兩類(lèi)： 類(lèi)型拓?fù)洚悩?gòu)酶使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和連接，無(wú)需能量供給。 類(lèi)型拓?fù)洚悩?gòu)酶使DNA的兩條鏈同時(shí)發(fā)生斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋是

20、需要由ATP供給能量。 類(lèi)型I拓?fù)洚悩?gòu)酶首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，只能消除負(fù)超螺旋， 與DNA結(jié)合時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定 的復(fù)合物。在作用的過(guò)程中，只斷開(kāi)DNA的一條鏈。在DNA的一條鏈被切開(kāi)后，由于酶與DNA結(jié)合，DNA鏈并不能自由轉(zhuǎn)動(dòng)，超螺旋DNA的扭曲和張力不會(huì)自動(dòng)消失。但酶分子牽引另一條鏈通過(guò)切口，然后使斷鏈重新連接，從而改變DNA連環(huán)數(shù)和超螺旋數(shù)。該酶主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II 細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)是一種類(lèi)型的拓?fù)洚悩?gòu)酶，稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶II，它可連續(xù)引入負(fù)超螺旋到同一個(gè)雙鏈閉環(huán)DNA分子(正超螺旋）中去，可以消除復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)帶來(lái)的扭曲張力，

21、從而促進(jìn)雙鏈的解開(kāi)。而將DNA雙鏈解開(kāi)則有賴于DAN解旋酶（helicase）（應(yīng)為解鏈酶）。 它通過(guò)水解DNA獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈。解開(kāi)的雙鏈隨即被單鏈結(jié)合蛋白（ SSB）覆蓋。它的功能在于穩(wěn)定DNA解開(kāi)的單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈部分不被核酸酶降解。該酶分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部位，同復(fù)制有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶正超螺旋負(fù)超螺旋（六）DNA復(fù)制的過(guò)程 大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制過(guò)程可分為三個(gè)階段： 復(fù)制的起始 復(fù)制的延伸 復(fù)制的終止 期間的反應(yīng)和參與作用的酶與輔助因子各有不同。在DNA合成的生長(zhǎng)點(diǎn)(growth point),即復(fù)制叉上，分布著各種各樣的與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，它們構(gòu)成的復(fù)合物

22、稱為復(fù)制體(replisome)。DNA復(fù)制的階段表現(xiàn)在復(fù)制體結(jié)構(gòu)的變化。蛋 白 質(zhì)相 對(duì)分子量亞基數(shù)目功 能DnaADnaBDnaCHU引物合成酶單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）RNA聚合酶DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）Dam甲基化酶520003000002900019000600007560045400040000032000 1 6 1 2 1 4 5 4 1識(shí)別起點(diǎn)序列，在起點(diǎn)特異位置解開(kāi)雙鏈解開(kāi)DNA雙鏈幫助DnaB結(jié)合于起點(diǎn)類(lèi)組蛋白，DNA結(jié)合蛋白，促進(jìn)起始合成RNA引物結(jié)合單鏈DNA促進(jìn)DnaA活性釋放DNA解鏈過(guò)程產(chǎn)生的扭曲張力使起點(diǎn)GATC序列的腺嘌呤甲基化大腸桿菌起點(diǎn)與復(fù)制有關(guān)的酶

23、與輔助因子 P422表34-4DNA被引發(fā)體(DnaB) 分開(kāi)DnaB:解開(kāi)DNA雙鏈引物前導(dǎo)鏈滯后鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA聚合酶1、復(fù)制的起始大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)稱為ori C，由245個(gè)bp構(gòu)成，其序列和控制元件在細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)中十分保守。關(guān)鍵序列在于兩組短的重復(fù)：三個(gè)13bp的序列和四個(gè) 9bp的序列。富含AT13bp大腸桿菌復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)2. HU蛋白是細(xì)胞的類(lèi)組蛋白，可與DNA結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲。受其影響，鄰近三個(gè)成串富含AT的13bp序列被變性，成為開(kāi)鏈復(fù)合物（open complex）,所需能量由ATP供給。大腸桿菌DNA復(fù)制的起始識(shí)別起點(diǎn)序列促使雙鏈DNA彎曲富含AT序列

24、首先解鏈解開(kāi)DNA雙鏈1. DnaA識(shí)別起點(diǎn)序列4. DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)發(fā)生在起始階段，一旦開(kāi)始復(fù)制，如無(wú)意外受阻，就能一直進(jìn)行到底完成。3. DnaC幫助DnaB結(jié)合于起點(diǎn)，DnaB解開(kāi)DNA雙鏈。 2、DNA復(fù)制的延伸 復(fù)制的延伸階段同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成，二者合成的基本反應(yīng)相同，都由DNA聚合酶所催化；但兩條鏈的合成也有顯著區(qū)別，前者連續(xù)合成，后者分段合成，參與的蛋白質(zhì)因子也有所不同。 前導(dǎo)鏈開(kāi)始合成后通常都一直繼續(xù)下去。前導(dǎo)鏈的合成與復(fù)制叉的移動(dòng)保持同步。 滯后鏈的合成是分步進(jìn)行的，需要不斷合成岡崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶加入脫氧核糖核苷酸。（引物合成酶）3、DNA復(fù)制

25、的終止 細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉向前推移，最后在終止區(qū)(terminus region)相遇并停止復(fù)制，該區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)位點(diǎn)。大腸桿菌有6個(gè)終止子位點(diǎn)，與其結(jié)合的蛋白質(zhì)稱為 Tus。終止子在染色體上的位置如圖E見(jiàn)P424圖34-23A6個(gè)終止子沒(méi)有TerG大腸桿菌DNA復(fù)制的終止終止子： DNA分子中一段可終止復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)序列 DNA復(fù)制終止的最后一步反應(yīng)是兩個(gè)子代DNA的分離。當(dāng)DNA復(fù)制到最后，兩個(gè)子代DNA形成連環(huán)體（catenane）。連環(huán)體的分離由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV負(fù)責(zé)催化。 見(jiàn)P424圖 34-23B大腸桿菌DNA復(fù)制的終止 真核細(xì)胞含

26、有5種DNA聚合酶，即DNA聚合酶、和。它們的差別主要在于細(xì)胞中的定位、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和對(duì)抑制劑的敏感性三個(gè)方面。 DNA聚合酶用來(lái)合成引物。 DNA聚合酶是修復(fù)酶。 DNA聚合酶是線粒體DNA合成酶。 DNA聚合酶既有持續(xù)合成DNA鏈的能力，又有矯正功 能，由它完成DNA的復(fù)制。 DNA聚合酶可能相當(dāng)于細(xì)菌的DNA聚合酶，是一種修復(fù) 酶，參與DNA修補(bǔ)合成，并存在于復(fù)制叉用以 取代滯后鏈岡崎片段的引物。 （七）真核生物的DNA復(fù)制DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶定 位亞基數(shù)目外切酶活性引物合成酶 活 性持續(xù)合成能 力抑制劑功 能細(xì)胞核4無(wú)有中等蚜腸霉素引物合成細(xì)胞核1

27、無(wú)無(wú)低雙脫TTP修復(fù)線粒體23 -5外切酶無(wú)高雙脫氧TTP線粒體DNA合成細(xì)胞核23-5外切酶無(wú)有PCNA時(shí)高蚜腸霉素核DNA合成細(xì)胞核13-5外切酶無(wú)高蚜腸霉素修復(fù)哺乳動(dòng)物的DNA聚合酶P425 表 34-5（七）真核生物的DNA復(fù)制 真核生物DNA復(fù)制的速度比原核生物慢，基因組比原核的大，有多個(gè)起始點(diǎn)，可同時(shí)復(fù)制。其速度還是比原核生物快。 真核生物線性染色體的兩個(gè)末端具有特殊的結(jié)構(gòu)，稱為端粒（telomere），由許多成串的重復(fù)短序列構(gòu)成，該重復(fù)序列通常一條鏈富含G,其互補(bǔ)鏈富含C。它的功能是穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體間末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈5末端在消除RNA引物后造成的空缺。 復(fù)制

28、使端粒5末端縮短，端粒酶（telomerase）可外加重復(fù)單位到5末端，維持端粒一定長(zhǎng)度。端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，它以所含RNA為模板來(lái)合成DNA端粒結(jié)構(gòu)。二、DNA的損傷修復(fù) DNA常常會(huì)受到某些物理、化學(xué)或生物因素造成的損傷，例如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都能作用于DNA 使其結(jié)構(gòu)與功能破壞，引起生物突變甚至死亡。但是，在一定條件下，生物體能使其DNA損傷得到修復(fù)。 常見(jiàn)的DNA受損傷的因素及受損傷的類(lèi)型 見(jiàn)表修復(fù)系統(tǒng)主要有以下五種： (一)錯(cuò)配修復(fù) (二)直接修復(fù) (三)切除修復(fù) (四)重組修復(fù) (五)應(yīng)急反應(yīng)(SOS)和易錯(cuò)修復(fù)常見(jiàn)的DNA受損傷的因素及受損傷的類(lèi)型

29、受損傷的因素 受損傷的類(lèi)型受酸、受熱堿基脫落，特別是脫嘌呤自發(fā)自發(fā)脫氨基作用，如C U紫外線嘧啶二聚體，主要是胸腺嘧啶二聚體烷化劑，如硫酸二甲酯堿基修飾復(fù)制錯(cuò)誤堿基錯(cuò)配離子輻射，X-射線或宇宙射線DNA鏈斷裂化學(xué)交聯(lián)劑DNA鏈交聯(lián)（一）錯(cuò)配修復(fù) DNA的錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair)機(jī)制是在大腸桿菌的研究中證實(shí)的：DNA在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)配，如果新合成的鏈被校正，基因編碼信息可得到恢復(fù)；但是如果模板鏈被校正，突變就被固定。細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)能夠區(qū)分舊鏈和新鏈。新鏈的GATC序列中的A在短時(shí)期內(nèi)逐步甲基化，（舊鏈?zhǔn)且鸭谆模?，一旦錯(cuò)配，即將未甲基化的鏈切除修復(fù)。 原核細(xì)胞正是利用甲基

30、化作為區(qū)分新鏈和老鏈的標(biāo)記，因此原核細(xì)胞中的錯(cuò)配修復(fù)也稱為甲基化指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)（methyl-directed mismatch repair）(參見(jiàn)圖)。大腸桿菌DNA錯(cuò)配修復(fù)（二）直接修復(fù) 直接修復(fù)并不需要將受損傷的堿基切除，而是直接將受損傷的堿基變?yōu)檎５膲A基。紫外線照射可以使DNA分子中的同一條鏈兩相鄰胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體。嘧啶二聚體的形成，影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能均受到障礙。胸腺嘧啶二聚體的修復(fù)類(lèi)型很多，主要的有光復(fù)活修復(fù)和暗修復(fù)。嘧啶二聚體的形成過(guò)程如圖：光復(fù)活機(jī)制 光復(fù)活作用是一種高度專(zhuān)一的直接修復(fù)方式。它只作用于紫外線引起DNA嘧啶二聚體。光復(fù)活酶在生

31、物界分布很廣，從低等單細(xì)胞生物到鳥(niǎo)類(lèi)都有，但是高等動(dòng)物的哺乳類(lèi)卻沒(méi)有。紫外線損傷的光復(fù)活過(guò)程如圖另一種直接修復(fù)的例子是O6 -甲基鳥(niǎo)嘌呤的修復(fù)，參與修復(fù)作用的酶是6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶。光復(fù)活機(jī)制-嘧啶二聚體的直接修復(fù)A.形成嘧啶二聚體 B.光復(fù)活酶結(jié)合于損傷部位C.酶被可見(jiàn)光激活D.修復(fù)后釋放酶 紫外線損傷的光復(fù)活過(guò)程（三）切除修復(fù) 所謂切除修復(fù)，即是在一系列酶的作用下，將DNA 分子中受損傷部分切掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成切去的部分，然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過(guò)程。 切除修復(fù)包括兩個(gè)過(guò)程：一是由細(xì)胞內(nèi)特異的酶找到DNA的損傷部位，切 除含有損傷結(jié)構(gòu)的核酸鏈。二是修復(fù)合成

32、并連接。（三）切除修復(fù) 細(xì)胞內(nèi)有許多種特異DNA糖苷酶，它們能識(shí)別DNA中不正常的堿基，而將其水解下來(lái)。烷化劑可使堿基被修飾。糖苷酶可識(shí)別并除去烷基化堿基。 烷基化（三）切除修復(fù) DNA中無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)常稱為AP位點(diǎn)。 AP位點(diǎn)可由DNA的堿基被修飾后造成N-糖苷鍵不穩(wěn)定而自發(fā)水解產(chǎn)生; 酸也能使DNA脫嘌呤產(chǎn)生AP位點(diǎn)。 通常只有單個(gè)堿基缺陷才以堿基切除修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)。如果DNA損傷造成DNA螺旋結(jié)構(gòu)較大變形，則需要以核苷酸切除修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)。 損傷鏈由切除酶切除。該酶也是一種核酸內(nèi)切酶，在鏈的損傷部位兩側(cè)同時(shí)切開(kāi)。切除酶可識(shí)別多種DNA損傷，包括紫外線引起的嘧啶二聚體和其他光反應(yīng)產(chǎn)

33、物，堿基的加合物等。如圖（三）切除修復(fù)結(jié)構(gòu)缺陷切開(kāi)核酸內(nèi)切酶切除核酸外切酶DNA聚合酶DNA連接酶連接修復(fù)AP 核酸內(nèi)切酶切除堿基缺陷或錯(cuò)配N(xiāo)-糖苷鍵切掉DNA損傷的切除修復(fù)過(guò)程先后 或 先后 均可（四）重組修復(fù) DNA復(fù)制時(shí),尚未修復(fù)的損傷部位也可先復(fù)制再修復(fù),如：含有嘧啶二聚體，烷基化引起的交聯(lián)和其他結(jié)構(gòu)損傷的DNA仍然可以進(jìn)行復(fù)制，但是復(fù)制酶系在損傷部位無(wú)法通過(guò)堿基配對(duì)合成子代DNA鏈，它就跳過(guò)損傷部位，在下一個(gè)岡崎片段的起始位置或前導(dǎo)鏈的相應(yīng)位置上重新合成引物和DNA鏈，結(jié)果子代在損傷相對(duì)應(yīng)處留下缺口。參見(jiàn)P430圖34-30（四）重組修復(fù) 從同源DNA母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至子

34、鏈缺口處，然后用再合成的序列來(lái)補(bǔ)上母鏈的空缺。此過(guò)程稱為 重組修復(fù)，因?yàn)榘l(fā)生在復(fù)制之后，又稱為復(fù)制后修復(fù)(postreplication repair) .如圖（五）應(yīng)急反應(yīng)（SOS）和易錯(cuò)修復(fù) SOS反應(yīng)是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存所作出的應(yīng)急效應(yīng)。 SOS反應(yīng) 能誘導(dǎo)切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，使這些酶和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中含量升高，加強(qiáng)切除修復(fù)和重組修復(fù)的能力。 還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的DNA聚合酶，它能在損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免死亡，可是卻帶來(lái)了高變異率。 SOS反應(yīng)機(jī)制圖SOS反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)進(jìn)行修復(fù)三、DNA的突變DNA作為遺傳物質(zhì)有三個(gè)功能：一是通過(guò)復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代二是通過(guò)轉(zhuǎn)錄使遺傳信息在子代得以表達(dá)三是通過(guò)變異在自然選擇過(guò)程中獲得新的遺傳信息變異是DNA的核苷酸序列改變的結(jié)果，它包括