王不留行中抑制血管生成的活性物質(zhì)研究

1、王不留行中按捺血管天生的活性物質(zhì)研究花慧馮磊張小平張蓮芬金堅(jiān)【摘要】目的闡發(fā)王不留行中具有按捺血管天生的活性身分。要領(lǐng)別離在體外造就人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HE)和體內(nèi)雞胚絨毛尿囊膜(A)模子的實(shí)行引導(dǎo)下，從王不留行中分散得到兩種身分，用化學(xué)與光譜闡發(fā)法斷定其化學(xué)布局。效果這兩種活性身分別離為王不留行環(huán)肽A，E。結(jié)論王不留行中按捺血管天生的活性身分是王不留行環(huán)肽A，E。【關(guān)鍵詞】王不留行環(huán)肽王不留行環(huán)肽A，E血管天生王不留行系石竹科麥藍(lán)菜Vaariasegetalis(Nek)Garke的枯燥成熟種子,為傳統(tǒng)常用中藥,有行血通經(jīng),催生下乳,消腫斂瘡等成果。其植物資源富厚,除華南外,天下各地均有漫衍,

2、尤以河北產(chǎn)量最大1，據(jù)報(bào)道其含有生物堿、黃酮、皂苷及環(huán)肽類等身分。本文在按捺HE增殖活性實(shí)行和雞胚絨毛尿囊膜(A)實(shí)行的引導(dǎo)下，對王不留行舉行了體系地提取分散，終極得到兩種活性較高的身分，布局?jǐn)喽橥醪涣粜协h(huán)肽A、E。初次創(chuàng)造王不留行中環(huán)肽A，E具有按捺血管天生的作用。1東西1.1質(zhì)料與儀器AKTAexplrer100液相體系(Aersha公司)；SRB(Siga公司)；DB-131細(xì)胞造就基(GibBRL公司)；胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(華美生物工程公司)；ATERSPlatfrZD4000型液質(zhì)聯(lián)用儀(aters公司)；富立葉變更紅外光譜儀；del3110細(xì)胞造就箱(Ther-Fra公

3、司)；K3型酶標(biāo)儀(Ther-Lab-Systes公司)；王不留行藥材購自江蘇省無錫市山禾藥業(yè)股份，南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉傳授斷定為Vaariasegetalis(Nek)Garke。受精黃皮種蛋購自無錫馬山種雞常1.2細(xì)胞株人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HE)由法國國度衛(wèi)生醫(yī)藥研究院U553研究所(INSERU553)陸核傳授奉送，保存于液氮罐中。2要領(lǐng)2.1樣品提取與分散在體外按捺HE增殖活性實(shí)行引導(dǎo)下，按以下步調(diào)舉行闡發(fā)：將5kg王不留行水煎煮兩次，提取液靜置，離心，去沉淀，上清液經(jīng)D-101型大孔樹脂柱，依次以水，30%乙醇，50%乙醇，75%乙醇洗脫。網(wǎng)絡(luò)75%乙醇洗脫液，接納濃縮至無乙醇味，再用

4、正丁醇萃取，取正丁醇萃取物經(jīng)反相Resure柱分散，H3N梯度洗脫得到組分A16.8g,tR35in)和組分B24g,tR42in)。2.2細(xì)胞造就將HE用含1l/L谷氨酰胺、1g/L氫化可的松、10g/LEGF和150l/L小牛血清的DB-131造就液,于37，50l/L2造就箱中傳代造就。2.3SRB實(shí)行參照Skehan等2報(bào)道的SRB要領(lǐng)測定組分A、B對HE增殖的按捺率。取對數(shù)生恒久細(xì)胞，按每孔70008000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中安排于37，50l/L2的造就箱中造就留宿，參加差異濃度的組分A、B，以不加藥組為陰性比較造就72h。去上清液,每孔輕輕參加100g/L三氯醋酸100l結(jié)實(shí),

5、靜置5in后移到4再安排1h倒掉結(jié)實(shí)液,用去離子水洗5次,氣氛枯燥。每孔參加4g/LSRB100l室溫安排30in，用10l/L醋酸液洗5次，參加150l10l/LTris堿液(pH10.5)溶解，用K3型酶標(biāo)儀在波長A570處測定每孔A值。盤算按捺率(%)同時(shí)繪制藥物濃度按捺率曲線,求出半數(shù)細(xì)胞按捺濃度(I50)。按捺率%=(比較組的A值-藥物組的A值)/(比較組的A值-空缺組的A值)100%。2.4A血管天生實(shí)行受精黃皮種蛋，參考文獻(xiàn)要領(lǐng)3制備雞胚尿囊膜。用打孔器制備直徑為6的微孔濾膜圓片，濕熱高壓消毒。設(shè)組分A、B給藥組和生理鹽水陰性比較組。將藥物滴于濾紙上，制成藥膜，吹干備用。雞胚造就

6、3d后分組，將藥膜貼于A的部位。加藥48h后，不雅察藥膜四周的血管數(shù)，并拍照記載。2.5組分A、B的液質(zhì)聯(lián)用闡發(fā)2.6組分A，B的紅外光譜闡發(fā)接納KBr壓片法。2.7組分A，B的氨基酸闡發(fā)根據(jù)GB/T18246-2000的要領(lǐng)闡發(fā)。3效果3.1活性斷定圖1組分A，B對HE-1體外增殖的按捺作用略圖2組分A，B對A新生血管天生的影響(10)略3.2布局?jǐn)喽▓D3組分A，B布局圖略4討論血管天生(angigenesis)指的是構(gòu)造使用既存血管產(chǎn)生新的血管的歷程。正常生理環(huán)境下，僅產(chǎn)生于創(chuàng)傷修復(fù)或月經(jīng)周期的卵巢和子宮內(nèi)膜，但很多疾病如腫瘤，可出現(xiàn)連續(xù)的、不成操縱的血管天生。新血管天生是癌腫生長和擴(kuò)散的

7、需要條件，抗血管天生大概是限定腫瘤生長和防范轉(zhuǎn)移的良策。使用血管天生按捺劑特異性地按捺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和雞胚絨毛尿囊膜血管天生的活性，可按捺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，開展按捺腫瘤血管的藥物挑選研究是抗腫瘤研究的熱門。如今國表里臨床不乏有用的抗血管天生藥物,但大多有用藥物在按捺血管天生的同時(shí)存在不成對抗的副作用,如出/凝血非常、加重心血管疾并影響成年婦女卵泡發(fā)育和正常的月經(jīng)周期等6，因此限定了其臨床應(yīng)用。鑒于自然藥物毒副作用小,人們開始從自然藥物中探求有用的血管天生按捺劑。本實(shí)行中以血管內(nèi)皮細(xì)胞SRB實(shí)行和雞胚絨毛尿囊膜(A)實(shí)行為模子，從中藥中挑選得到王不留行水提取具有較強(qiáng)按捺血管天生的作用，進(jìn)而接

8、納樹脂吸附、萃娶反相中壓層析等本領(lǐng)對王不留行舉行體系提取分散純化，得到王不留行環(huán)肽A,E,二者均有較強(qiáng)的按捺HE增殖和雞胚絨毛尿囊膜的血管天生的生物活性，此中環(huán)肽E的作用強(qiáng)于環(huán)肽A，這是以往文獻(xiàn)未見報(bào)道的。因此可以將王不留行環(huán)肽A,E作為血管天生按捺劑的藥用先導(dǎo)化合物來研究，具有臨床開拓使用的代價(jià)。【參考文獻(xiàn)】1江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.上海：上海人民出書社，1997：311.2SkehanP,StrengR,SudierD,etal.Nelrietriyttxiityassayfrantianer-drugsreeningJ.JNatlanerInst,1990,82(13)：1107.3張樹成，吳志奎，王蕾，等.研究中藥血管天生活性和作用的雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)?zāi)Ｗ拥膽?yīng)用J.中國中醫(yī)底子醫(yī)學(xué)雜志，1999，5(5)：16.4ritaH,YunSK,TakeyaK,etal.AyliheptapeptidefrvaariaStgetalis,1996,42：439.5ritaH,YnuSK,ItkaaH,etal.nfratinalanalysisfayliHexapeptide,SegetalinAfrVatariaSegetalis1995,