川大學-生物技術-綜合實驗報告-學生版

1、生物技術綜合實驗甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( -GCS)基因的克隆和原核表達學生 ：學號：同實驗者 ：研究背景谷胱甘肽 (glutathione, GSH) GSH 具有多種重要生理功能 , 抗自由基和抗 氧化應激作用 , 保護細胞膜的完整性等。 -GCS是植物細胞中 GSH生物合成的 限速酶 , 可以調控 GSH的生物合成量。 GSH在生物體抵御冷害、干旱、重金屬、 真菌等脅迫過程中起著重要作用 , 說明 -GCS也與植物抗逆過程密切相關。實驗一 甘薯葉片 RNA提取一、實驗目的了解真核生物 RNA提取的原理；掌握 Trizol 提取的方法和步驟。二、實驗原理Trizol? 試劑是由苯酚

2、和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總 RNA的試 劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持 RNA 的完整性。 TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中 的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。 苯酚雖可有效地變性蛋白質， 但不能完全抑制 RNA酶活性，因此 TRIzol 中還加入了 8羥基喹啉、異硫氰酸胍、 - 巰基乙醇 等來抑制內源和外源 RNase(RNA酶)。%的 8羥基喹啉可以抑制 RNase，與氯仿 聯(lián)合使用可增強抑制作用。 異硫氰酸胍屬于解偶劑， 是一類強力的蛋白質變性劑， 可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失， 導致細胞結構降解， 核蛋白迅

3、速與核酸 分離。 - 巰基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質中的二硫鍵。在氯仿抽提、 離心分離后， RNA處于水相中，將水相轉管后用異丙醇沉淀 RNA。用這種方法得 到的總 RNA中蛋白質和 DNA污染很少。三、實驗材料材料甘薯（ Ipomoea batatas Lam ）葉片，品種為徐薯 18試劑無 RNA酶滅菌水：加入 %的 DEPC，處理過夜后高壓滅菌；Trizol 試劑；氯仿；異丙醇、 75乙醇；TBE 緩沖液；上樣緩沖液（ 6）儀器 高壓滅菌鍋、微量移液器、臺式離心機、超凈工作臺、電泳儀、電泳槽、凝膠成 像系統(tǒng)、塑料離心管、槍頭和 EP管架四、實驗方法將葉片取出放入研缽中，加入適

4、量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg 植物葉片加入 1 mL Trizol 試劑，室溫放置 5 min ，使樣品充分裂解；每 1 mLT rizol 試劑加入 200 L氯仿，用手劇烈振蕩混勻后室溫放置 3-5 min 使其自然分相；4 12,000 rpm 離心 15 min ，吸取上層水相轉移到新管中；在上清中加入 等體積冰冷的異丙醇，室溫放置 15 min ；4 12,000 rpm 離心 10 min ，棄上清， RNA沉淀于管底；RNA 沉淀中加入 1 mL 75%的乙醇（用 RNase-free 水配制），溫和震蕩離心管， 懸浮沉淀； 4 8,000 rpm 離心 2 mi

5、n ，棄上清；室溫放置 10 min 晾干沉淀；沉淀中加入 20L RNase-free ddH2O，輕彈管壁，以充分溶解 RNA，- 70保 存；用 1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用 EB染色并照相五、實驗結果1. RNA提取結果依照 Trizol? 試劑盒方法，提出的 RNA較少，此部分未以圖或數據顯示。2. RNA 后電泳結果如圖 1. 其中 9a 為本組實驗結果。由圖可知 RNA條帶非常模糊，拖尾現(xiàn)象 嚴重，幾乎無法分清具體條帶，亮度較大。點樣孔附近的紅色部分為雜質，在提 取過程中并未很好除去。圖 1. RNA提取跑膠結果。其中 1 泳道為樣品 Marker ， 9a 泳道為本小組 R

6、NA樣品。與標 準對照可見條帶模糊，拖尾現(xiàn)象嚴重。六、分析與討論1. RNA 的提取產量并不多， 可能是因裂解樣品不充分或 RNA沉淀未完全溶解所致。 在實驗 過程中， 由于對操作時間的掌握不熟練、 操作技巧不完善， 留上清與棄上清時令 RNA損失了部分，使最終 RNA產量不理想。2. RNA 電泳結果有 EB存在時，電泳后 28S rRNA和 18S rRNA 在紫外燈下應看得很清楚，另出現(xiàn)條由 tRNA， rRNA和 5S rRNA組成的較模糊、遷移較快的帶。如果 RNA沒有 降解，則 28S rRNA的亮度應為 18S rRNA的 2 倍，且這兩條帶都無彌散現(xiàn)象發(fā)生。 由圖 1. 9a

7、可知， RNA拖尾現(xiàn)象嚴重，說明 RNA已大部分被降解；此外點樣孔附 近出現(xiàn)紅色部分雜質，分析可能有并未除盡的蛋白質，同樣影響RNA電泳結果。在進行實驗時，本小組成員未嚴格戴上口罩并勤換手套，這可能使外源 RNAase進入樣品，導致其降解嚴重。另外，提取出 RNA后本小組未立即將樣品 放入- 70保存，也為導致結果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分層 的過程中，由于水相吸取過多，摻雜入部分蛋白質雜質而未于后續(xù)純化步驟除盡， RNA條帶拖尾嚴重可能還受該蛋白質影響。七、總結：本次試驗 RNA提取非常失敗， 從跑膠結果可見其降解嚴重。 雖然大實驗無法 避免試劑交叉污染的可能性，且電泳用膠的質

8、量也會影響實驗結果，但從圖 1. 2a，3a，2b 等條帶較為清晰的小組實驗結果可知，瓊脂糖凝膠質量以及試劑對 結果干擾不大。 那么本小組成員在提取過程中的操作一定出現(xiàn)了很大失誤。 首先 口罩、手套應該嚴格按規(guī)定佩戴， 提取過程對移液槍等儀器使用需謹慎仔細， 盡 量避免混入雜質。 其次為排除部分雜質影響可對 RNA樣品用紫外線分光光度計測 定吸光值檢驗，將有助于結果分析。最后，細節(jié)決定成敗，我們應汲取教訓避免 接下來的實驗出現(xiàn)類似問題。實驗二 第 1 鏈 cDNA的合成和模板的驗證一、實驗目的掌握第 1 鏈 cDNA的合成方法和步驟二、實驗原理真核生物基因多為斷裂基因， 編碼區(qū)不連續(xù)， 需經轉

9、錄后加工才能成為成熟 mRN。A 以真核成熟 mRNA為模板合成 cDNA，進而獲得有連續(xù)氨基酸編碼的 DNA序 列，無需轉錄后加工，即可在原核細胞中表達。真核生物的 mRNA都有 PolyA 尾巴。引物： Oligo dT （ 12-18 個 T）。莫洛尼Total RNA2 L氏鼠白血病毒逆轉錄酶 （M-MLV） 以單鏈 RNA為模板， 在引物的引發(fā)下合成與模 板互補的 DNA鏈（ cDNA）。mRNA 反轉錄生成的 cDNA可作為 PCR的模板進行擴增稱為 RT-PCR， RT-PCR 比 Northern 雜交更靈敏，對 RNA的質量要求較低，操作簡便，它是在轉錄水平 上檢測基因時空表

10、達的常用方法。三、實驗材料材料徐薯 18 葉片 RNA樣品試劑dNTP mixture ( 10 mM each)； TOC o 1-5 h z Oligo (dT) Primer (10 M)；Total RNA ；RNase free ddH2O ；M-MLV 反轉錄酶；5 First-strand Buffer；M DTT ；Ribonuclease Inhibitor (40 U/ L)儀器10L 和 100L 的移液槍、的 EP管、 PCR儀等四、實驗方法1. 在 RNase free Microtube 管中配制下列混合液：1 L4 LdNTP mixture (10 mM eac

11、h) *Oligo (dT) Primer (10 M)RNase free ddH 2Oup to 12L2. 將混合物 65 C加熱 5 min ，迅速在冰上冷卻 2 min ，快速離心，然后加入下列成分：5First - strand Buffer4LM DTT 2LRibonuclease Inhibitor (40 U/L)1 L3. 將混合物輕輕混勻， 37溫浴2 min ；加入 M-MLV反轉錄酶（ 200U/L）1 L，用槍頭輕輕吹打混勻；37 溫浴 50 min ；70 加熱 15 min ，使反轉錄酶失活，所得反轉錄產物可直接用于 PCR反應附 反轉錄模板的看家基因的驗證（

12、 -actin ） 引物primerssequencessizeIbActinF5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3198bpIbActinR5-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3以第一鏈 cDNA為模板，-actin-F 和 -actin-R 為引物，使用 Taq 酶進行 PCR。表 1 -actin PCR 反應體系（ 25L體系）DNA模板1L(約 50 ng)10PCR緩沖液(Mg2+ plus)LMg2+L10 mol/L TPS -F1 L10 mol/L TPS -R1Lmmol/L dNTPLTaq 酶L滅菌去離子水L合計25 L* PC

13、R反應條件94 2min95 30sec30個循環(huán)62 30sec6830sec最后， 1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增產物。五、實驗結果-actin 驗證如圖 1. 其中編號 1為 Marker，3為本小組 RNA樣品-actin 驗證結果。 由圖可知，使用 RNA模板通過 RT-PCR得到了長度為 198bp類似條帶，但因產物 濃度較低，該條帶不甚清晰，并有部分彌散現(xiàn)象發(fā)生。圖 1. -actin 驗證電泳結果。其中編號 1為 Marker ，編號 3為本小組 RNA樣品經 RT-PCR 在加入引物 IbActinF 、 IbActinR 后擴增出的-actin 產物。六、分析與討論1. RN

14、A 提取因實驗一本小組 RNA提取失敗，故此實驗采用老師準備的 RNA進行驗證。-actin 驗證結果如圖 1. 第 3組為本小組驗證結果。其中 -actin 能被 cDNA模板擴增出， 但條帶模糊并有拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。首先，因所得產物量較少，故電泳條帶模糊，推 測可能是在進行 RT-PCR前， RNA有部分降解或于操作過程中損失部分所致。其 次，本實驗在對-actin 產物進行電泳后結果出現(xiàn)拖帶，可能原因主要有： 1) cDNA第一鏈產物的含量過高； 2) DNase降解 DNA產生的寡核苷酸有非特異性擴 增； 3)PCR反應中引物過多； 4)循環(huán)次數過多； 5)退火溫度過低； 6)Taq 酶

15、過多； 7)Mg2+濃度不合適。綜合本次試驗分析，因實驗條件已預先經過嘗試， 故導致拖帶的最可能因素應為 cDNA降解產生了寡核苷酸非特異性擴增片段。由 于照片清晰度欠佳，非特異性擴增片段無法清晰顯示，但若與圖 2. 進行對比則 可發(fā)現(xiàn)第 2 組 -actin 驗證圖出現(xiàn)了非特異性擴增片段。圖 2. 第 2 組 -actin 驗證圖。其中 1為 Marker ，編號 2、6 可見清晰的兩條帶。 若要進行改進，則需盡量提取高質量 RNA，防止其被 DNA污染。另外進一步 優(yōu)化 PCR反應條件也是必不可少的環(huán)節(jié)， 提高退火溫度可防止非特異性起始與延 伸。七、總結本次實驗雖只進行了模板驗證，但讓我們

16、理解了 RT-PCR的原理與其在真核 生物基因克隆方面的運用。整個過程中本小組成員較嚴格按照操作規(guī)范進行，所得-actin 產物驗證也較成功。今后實驗需更加注意細節(jié)，不斷完善自己的操作技巧，積累經驗。實驗三 甘薯 -谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( -GCS)基因克隆一、實驗目的1. 掌握 PCR的方法和步驟。二、實驗原理聚合酶鏈反應 (PCR)是 80 年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特 異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；目的基因或 某一 DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍。 其特異性依賴于與靶序列兩端 互補的寡核苷酸引物。 PCR由變性- 退火- 延伸三

17、個基本反應步驟構成：模板 DNA的變性：模板 DNA經加熱至一定溫度后， 使模板 DNA雙鏈解離， 成為 單鏈，與引物結合，為以下的反應作準備；模板 DNA與引物的退火 (復性)：模板 DNA經加熱變性成單鏈后， 溫度降至 55 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結合。引物的延伸： DNA模板 - 引物結合 物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為 反應原料，靶序列為模板， 按堿基配對與半保留復制原理， 合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性 - 退火- 延伸三過程， 就可獲得更多的“半保留復制鏈”， 而且這 種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 每完成一個循

18、環(huán)需 2-4 分鐘，2-3 小時就能將 待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。三、實驗材料材料反轉錄產物 DNA樣品2. 試劑dNTP mixture ( 10 mM each)；第一 cDNA ； -actin 的引物 ( IbActinF 和 IbActinR )； -GCS的引物 ( -GCS-F 和 -GCS-R )；10 PCR緩沖液 (Mg2+ plus) ；Taq 酶；儀器PCR 儀、 L、10L 和 100L 的移液槍、的 EP管、電泳儀。四、實驗方法1. 擴增甘薯 -GCS基因的引物primerssequencesSize-GCS -F-GCS -R:5- CGGGATACTCGGC

19、GTTGATGTCCCAATCTG-3 斜體： BamHI 酶切位點1575bp:5- CCGCTCGTACGAATAGAGCAGCTCCTCAAATAC-3 斜體： XHOI 酶切位點甘薯 -GCS基因的 PCR擴增 甘薯 -GCS基因的 PCR擴增體系（表 2）（25L體系）以第一鏈 cDNA為模板， F 和 R為引物，使用 Taq 酶高保真酶進行 PCR；表 2 -GCS PCR 反應體系DNA模板1L(約 50 ng)10PCR緩沖液 (Mg2+ plus)LMg2+L10 mol/L -GCS -F1 L10 mol/L -GCS -R1Lmmol/L dNTPLTaq酶L滅菌去離子

20、水14 L合計25 L. PCR 反應條件944min94 40sec65 30sec35 個循環(huán)72 2min1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增產物，并進行膠回收純化；甘薯 -GCS基因 PCR產物膠回收按照膠回收試劑盒的說明書進行：1）將 PCR產物在 1%瓊脂糖凝膠中電泳，5V/cm電泳 1 h 后，溴乙錠（或者 Goldview ） 染色，在紫外燈下切下 2500 bp 左右大小片段的凝膠；2）稱凝膠重量，按 1 g/mL 體系加 Binding buffer ，在 55C水浴中孵 5 min ， 直到凝膠完全溶解；3）將凝膠溶液到 DNAs pin-column 中，室溫放置 2min ，

21、1,2000 rpm離心 1 min， 棄廢液；4）用 700 L washing buffer 洗滌柱子， 1,2000 rpm 離心 1 min ；5）棄廢液后再 1,2000 rpm 離心 2min，以除去殘存的 washing buffer ；6）把 column 放到另一干凈的 mL 離心管，加 50L elution buffer ，室溫放置2 min 后， 1,2000 rpm 離心 1 min 以洗脫 DNA；pET-32a 質粒的 BamHI 和 XHOI 雙酶切 酶切體系（ 10L體系）： buffer ( BamHI) 1 LBamHI LXhoIL質粒L酶切反應： 37

22、水浴中孵化 1h；甘薯-GCS合成酶基因膠回收產物的 BamHI和 XHOI 雙酶切酶切體系（ 10L體系）：buffer ( BamHI) 1LBamHILXhoILPCR膠回收產物L酶切反應： 37水浴中孵化1h 。五、實驗結果1. 甘薯 -GCS基因 PCR電泳圖如圖 1. 其中 1 為 Marker（最大片段 2kb），4a 為本小組甘薯 -GCS基因 PCR擴增產物。由圖可知該組各條帶均較明亮清晰，模板經引物 R、F 擴增后得 大小在 1575bp 左右的目標產物，即約，跟 Marker 對比并進行了標注（圖 1. 紅 色框）。另圖中除標注部分以外還出現(xiàn)多余條帶，但因后續(xù)實驗采取割膠

23、回收方式獲得 -GCS基因片段，故其余片段不會對實驗結果造成影響 -GCS基因左右右圖1. 甘薯 -GCS基因 PCR電泳圖。其中編號 1為 Marker ，4a 為本小組 -GCS基因 電泳結果。紅框已圈出 -GCS所在條帶位置，大小在左右。六、分析與討論1. 甘薯 -GCS基因 PCR電泳結果由圖 1. 4a 可知，本次甘薯 -GCS基因 PCR較為成功。該產物條帶比較明亮，邊緣整齊，但除目的條帶外仍擴增出了不少多余條帶， 說明 DNA模板存在小 部分降解。實驗過程中應盡量避免 DNAase污染以及機械剪切力損傷樣品，而操 作時更應注意加樣時間， 經分析電泳結果出現(xiàn)非目的基因小片段可能是加

24、樣時間 過長引起的。，以使另外，本實驗在電泳時還可設計陰性對照（滅菌去離子水、緩沖液） 結果更加完善膠回收與雙酶切由于嚴格按照實驗步驟進行，膠回收與雙酶切均完成較好。此處未以數據、 圖片表示。七、總結本次實驗包括 PCR -GCS基因片段（目的基因）并作電泳檢測、膠回收純 化目的基因以及 BamHI、XhoI 雙酶切質粒與目的基因三個步驟。 由實驗結果可知 目的基因擴增較為成功，雖有多余雜質出現(xiàn)但條帶仍然清晰、整齊。膠回收時， 溶液放置 2min 是為使 buffer 與產物溶液混合均勻并穩(wěn)定以減少雜質影響， 最后 雙酶切的孵化時間與溫度是關鍵， 故于操作過程中我們應注重細節(jié)， 多體會才能 理

25、解、掌握成功要領。實驗四 原核表達質粒構建一、實驗目的掌握連接和轉化步驟。二、實驗原理DNA 體外連接即在一定條件下， 由 DNA連接酶催化兩個雙鏈 DNA片段相鄰 5 端磷酸、 3端羥基間形成磷酸二酯鍵的過程， DNA分子的連接是在酶切反應獲 得同種酶互補序列基礎上進行的。 連接反應成功與否， 最后的檢測要轉化宿主菌、 陽性克隆的篩選來確定。 質粒轉化不同細菌有不同的轉化效率， 轉化效率的高低 與實驗的成敗直接相關，通常轉化效率可達 105-107轉化子/ g DNA，獲得高轉 化效率的關鍵是感受態(tài)細菌的制備。體外通過基因工程手段所構建含目的基因的重組質粒，通過轉化和篩選技 術，可獲得含重組

26、子的陽性克隆。在此陽性克隆中， DNA可在生物體系內大量擴 增、繁殖、保存及表達目的基因產物，這是 PCR體外擴增 DNA所不能替代的。配 合 DNA重組技術所獲得的陽性菌株已廣泛應用于科研， 醫(yī)藥生產和生物發(fā)酵等領 域。三、實驗材料材料甘薯 -GCS基因酶切片段、載體片段2. 試劑10 T4 DNA ligase buffer ；T4 DNA ligase ；ddH2O ；SOC 培養(yǎng)液；buffer BamHI ；DMSO；TFB 溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2，10 mmol/L CaCl 2,10 mmol/L K-MES ；- 巰基乙醇；儀器：

27、10L 和 200L 移液槍、的 EP管、離心機、培養(yǎng)皿、電泳儀、 37 培養(yǎng) 箱、 4 冷藏室四、實驗方法1. 甘薯 -GCS基因酶切產物與 pET-32a 酶切產物的連接連接體系（ 10L體系）：10T4 DNA ligase buffer1載體片段4LPCR酶切片段3LT4 DNA ligaseLddH2OL連接條件： 16連接過夜；2. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備1）接種 JM109于 2 mL SOB培 養(yǎng)基 中， 37振蕩培養(yǎng)過夜；2）取 mL菌液轉種于 50 mL SOB培養(yǎng)基中， 37振蕩培養(yǎng) h （OD 550值約為后， 冰浴 10 min ，4, 000 r/min 離心 5

28、 min ，棄上清液；3）加入 17mL預冷的 TFB溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2，10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L K-MES 洗滌菌體 1 次，離心收集菌體；4）加入 4 mL TFB制成懸液，冰浴 10 min ，加入 140L二甲基亞砜 （DMSO，） 冰浴上輕輕轉動 10 min，加入 140 L -巰基乙醇，于冰浴上輕輕轉動 10 min， 再加入 140 L DMSO，輕輕混勻后在冰浴上靜置 5 min ，即得感受態(tài)細胞；連接產物的轉化1）在預冷的 EP管中加入 1-10 L質粒 DNA，加入 200 L上述感受態(tài)細胞，

29、 混勻后在冰浴上靜置 30 min ；2）42水浴熱沖擊 30 s，冰浴上放置 10 min，加入 mL SOC培養(yǎng)液。置于 37 振蕩培養(yǎng) 1 h ；3）取 mL 涂布于加有抗生素的 LB培養(yǎng)基平板上， 37 培養(yǎng)過夜。若轉化子很 少，特別是連接 DNA的轉化，可將轉化細胞離心 3 min （4,000 r/min） ，棄上清 液，把所有的菌體涂布在含相應抗生素的平板上；4）正放于 37培養(yǎng)箱內約 1h 使接種物完全被吸收，然后將平板倒置于 37培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 1216h 后，將平板移入 4 （ 冰箱冷藏室 ） 放置數小時；質粒的小量提取：采用試劑盒（ Plasmid Mini Kit I

30、 ）方法進行提取 實驗前準備：1）使用前，將 RNase A全部加入 Solution I 中并于 4度保存；2）按下表用無水乙醇稀釋 DNA Wash Buffer ，并于室溫保存；D6942-00, 3 ：加入 ml 無水乙醇D6942-01,D6943-01 ：加入 80ml 無水乙醇D6842-02,D6943-02 ：每瓶中加入 80ml 無水乙醇離心操作方案：1）將帶有質粒的 接種于5ml LB/ 抗生素培養(yǎng)液中， 37C搖床培養(yǎng) 1216 h；2）取的菌液，室溫下 10,000 xg 離心1min收集細菌；3）倒棄培養(yǎng)基。加入 250ul Solution I/RNaseA混和液

31、，漩渦振蕩使細胞完全懸 ??；4）往重懸混和液中加入 250ul Solution II ，輕輕顛倒混勻 4-6 次。此操作避免 劇烈混勻裂解液且裂解反應不要超過 5 min ；5）加入350ul Solution III，溫和顛倒數次至形成白色絮狀沉淀；6）室溫下， 10, 000 xg 離心 10min；7）轉移上清液至套有 2ml收集管的HiBind DNA結合柱中，室溫下 10,000 xg離心1 min，倒去收集管中的濾液；8）把柱子重新裝回收集管，加入 500ul HBB uffer ，按上述條件離心，棄去濾液；9）把柱子重新裝回收集管，加入 700ul DNAW ash Buffe

32、r ，按上述條件離心，棄 去濾液。注濃縮的 DNA Wash Buffer 在使用之前必須按標簽的提示用無水乙醇稀 釋；10）棄去濾液，重復第 9步驟一次；11）棄去濾液，把柱子重新裝回收集管， 10,000 xg 離心空柱 2min以甩干柱子基 質。注不要忽略此步這對去除柱子中殘留的乙醇至關重要；12）把柱子裝在干凈的離心管上，加入 30-50ul Elution Buffer（10mM Tris-HCl, 或無菌水到柱子基質中，靜置 1- 2min ，10,000 xg離心1min洗脫出 DNA；重組子的 PCR鑒定。五、實驗結果：1. 重組質粒粗提檢測如圖 1. 粗提后均出現(xiàn)了大小不同的

33、質粒， 較小者應為 pET-32a 質粒載體以 及原有質粒，較大者為重組質粒，而重組陽性質粒則需后續(xù)實驗鑒定。其中 4a 為本小組提取結果， 由于拍照條件不佳， 最大條帶較模糊 （圖中紅色方框圈出） ， 但仍能辨別出 3 條帶。原有質粒與 pET-32a 質?？蛰d體條帶最亮， 而成功轉化的 重組質粒條帶相對暗淡，很難分辨清楚。圖 1. 重組質粒粗提電泳檢測圖。 其中 4a 為本小組樣品條帶， 紅框圈出部分為重組質粒， 量較少。重組質粒 PCR檢測如圖 2. 所示， 2b即本小組實驗條帶， 9為 Marker 條帶（同實驗三）。以大 質粒為模板， -GCS- F 、R為引物進行 PCR，得左右條

34、帶十分清晰，已由圖中標 出。圖 2. 重組質粒 PCR電泳檢測圖。其中 9 為 Marker 條帶， 2b 由紅箭頭所指為本小組重組質粒 PCR條帶，大小在左右。六、分析與討論1. 重組質粒粗提電泳結果如圖 1. 可大致觀察到重組質粒的形成，但由于產量較少，重組質粒的轉化 率不好，分析可能是在進行目的基因與載體連接時成功率較低所致。 另因圖中無 Marker 顯示，對重組質粒的條帶確認增加了難度，單一完整 pET-32a 質粒與 E. Coli 受體菌自身已攜帶質粒的電泳條帶可起輔助分析作用，以使電泳結果更完 整。重組質粒 PCR電泳結果圖 2. 2b 條帶較為清晰整齊，說明有陽性重組質粒形成

35、，轉化成功。但條帶 稍有拖尾現(xiàn)象產生， 分析可能是由 PCR過程中升溫所導致的質粒不規(guī)則變性、 斷 裂而引起， 并形成了些大小不一的片段， 電泳時呈彌散狀分布于主條帶后， 分子 量較大。七、總結本次試驗過程中， 因酶切鑒定結果不理想而改用 PCR鑒定。對質粒進行提取 時的機械力損傷、 PCR升溫步驟均可導致質粒片段受損，這些失誤在操作或實驗 設計方面都需盡量避免， 雖然重組質粒量較少但其能成功轉化受體菌， 這也為隨 后 IPTG 誘導目的基因表達 -GCS產物打下了一定基礎。 多做、多思考、多總結， 才能于每個環(huán)節(jié)中學習到更多知識。實驗五 甘薯 -GCS基因的原核表達一、實驗目的1. 使用 I

36、PTG 誘導外源基因表達，了解篩選原理；2. 掌握 SDS檢測表達蛋白質的原理與方法。、實驗原理1. 表達系統(tǒng)是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入 菌株以后，通過溫度的控制， 誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質， 將表達樣品進行 SDS以 檢測表達蛋白 質。本實驗采用異丙基硫代 - -D-半乳糖昔（ IPTG）誘導外源基因表達。lacI 是大腸桿菌中 lac 操縱子（ Operon）的調節(jié)基因，它所表達的阻遏蛋 白是 lac 操縱基因（ Operator ）的抑制因子，抑制轉錄啟動。當有乳糖存在時， 這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結合而失去對操縱基因的抑制，使 lac 操縱子上 的結構基因 lacZ

37、 （-半乳糖苷酶 ） 、 lacY （透性酶 ） 、lacA（ 乙?；D移酶）得 以正常表達，啟動轉錄。 IPTG（異丙基- -D-1-硫代半乳糖苷 ） 作為乳糖的類似 物與 lacI 阻遏蛋白結合而使操縱基因不被抑制， 因此 IPTG 經常作為 lac 操縱子 的誘導劑運用于篩選。2. SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAG）E使用含有十二烷基硫酸鈉（ SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質樣品進行處理（一般煮沸 3-5 分鐘），通過加熱和 SDS可以使蛋白質 變性，多亞基的蛋白質也將解離為單亞基。SDS是變性劑，它能破裂蛋白質分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二

38、硫鍵以使蛋白質分子處于伸展狀態(tài)。 蛋白質在電場中的遷移率取決于它所帶的凈 電荷以及分子大小和形狀等因素。 加入 SDS（十二烷基磺酸鈉） 和少量巰基乙醇， 則蛋白質分子的遷移率主要取決于它的分子量， 而與原來所帶電荷、 分子形狀無 關。電泳過程中分子遷移的規(guī)律為：小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相 當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。四、實驗材料1. 材料已得甘薯-GCS基因陽性重組子2. 試劑誘導表達LB 培養(yǎng)基；SOC培養(yǎng)液；50 g/mL Amp；IPTG ；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳30%丙烯酰胺凝膠貯液： 丙烯酰胺 30 g， N, N- 亞甲雙丙烯酰胺 g ；4Tris Cl/SDS

39、 pH ： g Tris 堿溶解于 40 mL水中，用 1 mol/L 的鹽酸調 pH為后，定容到 100 mL，再加 g SDS；4Tris Cl/SDS pH ： g Tris 堿溶解于 40 mL水中，用 1 mol/L 的鹽酸 調 pH為后，定容到 100 mL，再加 g SDS；樣品緩沖液： 1 mL 4Tris Cl/SDS(pH ，1 g SDS，2 mL -巰基乙醇， 1 mL %溴酚蘭， 5 mL 甘油，加蒸餾水定容到 50 mL；電極緩沖液： g Tris 堿， g 甘氨酸， g SDS；固定液： 50%甲醇， 10%冰醋酸；染色液： %(w/v)考馬斯亮藍 R-250，

40、50%甲醇， 10%冰醋酸；脫色液： 7%冰醋酸， 5%甲醇；SDSLoading Buffer ；3、儀器 電泳儀、染液缸 五、實驗方法1. E. coli BL21 (DE3) 感受態(tài)的制備；2. 重組子轉化 BL21；原核表達挑取上述方法得到的單菌落于 2 mL LB 液體培養(yǎng)基 (氨芐青霉素 50 g/mL) 中。同時， BL21作為對照(不加抗生素) 。于 37培養(yǎng)至 OD600為；2）取 20 L菌液接種 2 mL LB 液體培養(yǎng)基 （ 氨芐青霉素 50 g/mL）, 37 培養(yǎng) OD600為；3）加入 IPTG 最終濃度梯度 2mM， 18誘導表達 16h；4）誘導結束后，用超聲

41、波破碎細胞；5）1mL菌液加入 100L的 SDSLoading Buffer ，100煮沸 5min；6）取 30L上清樣品點樣，分析 SDS膠，觀察表達結果；按下表配方制備 SDS凝膠，加樣。先 10 mA恒流電泳至分離膠，再調為 15 mA恒流到電泳結束；組分12%分離膠 (mL)%濃縮膠 （mL）丙烯酰胺貯液4Tris Cl/SDS, pH-4Tris Cl/SDS, pH-ddH2O10%過硫酸銨TEMED考馬斯亮藍染色（1）將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定 2 h ；（2）傾去固定液，以考馬斯亮藍染色液染色 4 h ；（3）傾去染色液，加入脫色液，緩慢搖動脫色。中間換脫色液，脫色到獲得藍 色條帶及干