REACH法規(guī)第四卷譯稿

1、B.10. 誘變（性）體外哺乳動物染色體變異測定1.方法這種方法是對1997年進行的試管中哺乳動物染色體異常測定的（theOECD TG 4 7 3 ）的復制。1.1. 引言體外哺乳動物染色體異常實驗的目的是證實在人工培養(yǎng)的哺乳動物 細胞（1） （2） （3）中能誘發(fā)染色體結構異常的媒質的存在。結構性 異常存在兩種方式：染色體異常，或者染色單體異常。大多數(shù)誘導有 機體突變的物質會引起染色單體異常，但是染色體異常也會發(fā)生。多 倍體的增加也可以證明一種化學物質有誘發(fā)染色體數(shù)目異常的潛力。 然而，這種方法不是為了測定數(shù)目異常而設計的，也不常用于此目的。 染色體變異以及相關變化是很多人類遺傳病的起因，

2、并且有確實的現(xiàn) 象證明染色體變異及其相關變化導致的體細胞中治癌基因和腫瘤抑 制基因的變化與人類和動物樣品的癌癥反應有關。體外哺乳動物染色體異常實驗要進行移植的細胞層，細胞株和初級細 胞群的培養(yǎng)。所選用的細胞應從培養(yǎng)中的生長能力，染色體組型平衡 能力，染色體數(shù)目，染色體多樣性，和染色體異常的自發(fā)頻率幾方面 進行挑選。在體外進行的測定通常需要借助于外加的代謝活化系統(tǒng)。在體外的測 定條件下，不可能完全模擬出哺乳動物樣品的新陳代謝系統(tǒng)。要小心控制條件，以避免無法表現(xiàn)內(nèi)在誘變的陽性的結果出現(xiàn)，及PH值、同滲重摩、細胞內(nèi)高毒素量(4 )(5 )的增長。這個實驗是用來辨認可誘導哺乳動物內(nèi)有機體突變的物質和致

3、癌物 質。哺乳動物體內(nèi)的致癌物質多數(shù)在這個測定中起正反應；但是此測 定并不能完全測定出體內(nèi)的致癌物。聯(lián)系是建立在化學物質的種類之 上的。不斷的事實證明，那些用此測定未被測定出的致癌物是通過機 械機制作用，而不是通過直接的 DNA 破壞來作用的。可參看綜合引言 B.1.2. 定義染色單體變異：通過單個的染色單體分解和染色單體的重組表現(xiàn)的結 構性染色體損傷。染色體變異：表現(xiàn)為同一位置的兩條染色單體的分解，或者分解后又 重組染色體結構損傷。核內(nèi)復制：在DNA復制的一個S時期后，核沒有進入有絲分裂，卻 開始另一個S時期的過程。結果是帶有4, 8, 16,染色單體的 染色體的出現(xiàn)?？p隙：在一個染色單體范

4、圍內(nèi)的最小程度的染色單體未對準錯誤。有絲分裂指數(shù)：細胞轉位期在一個細胞群中被總的細胞數(shù)目所分隔開的比率；是對該細胞群的增生擴散程度的反映。數(shù)目異常：染色體數(shù)目相對于細胞正常數(shù)目的變化。染色多體：單倍染色體（n）的復制而不是雙倍數(shù)染色體的復制（例 如 3n ， 4n 等等）；結構性異常：可由顯微鏡觀測到的有絲分裂細胞分化過程中的染色體 結構變化，能觀察到碎片，及內(nèi)在改變或交換。實驗原理細胞株要在有代謝活化作用和無代謝活化作用下與測定物接觸。在細 胞株與測定物接觸后的一定預定時間間隔后，用中間體捕獲物質（如Colemid或秋水仙素）處理，來捕獲過渡期的細胞。過渡期的細胞要 在顯微鏡下分析其染色體異

5、常表現(xiàn)。實驗步驟準備細胞可選用各種細胞列，細胞株和細胞群包括人的體細胞（如中國鼠類的 纖維原細胞、人類或其他哺乳動物淋巴中的淋巴細胞）。介質和培養(yǎng)條件應采用合適的培養(yǎng)媒介及培養(yǎng)條件（培養(yǎng)皿，co2濃度，溫度及濕度）來保存細胞群。需在染色單體數(shù)目的穩(wěn)定性和是否存在支原體污染兩 方面對選定的細胞列和細胞株進行定期測定。如已被支原體污染，應 不再選用。應該知道正常的細胞存活周期及存活條件。1.4.1.3.培養(yǎng)準備 選定細胞列和細胞株：從普通的細胞群繁殖細胞，在培養(yǎng)媒介中，以 一種在采樣前不會產(chǎn)生細胞群混合的濃度和370C的條件下進行培育。淋巴球: 血液用抗凝結劑(如肝磷脂)進行處理，后將從建康體中分

6、 離出的淋巴球中加入含有分裂素(如植物血球凝集素)的培養(yǎng)基，并 在37C下培育。1.4.1.4.新陳代謝活性細胞應在存在代謝活性和不存在代謝活性的條件下與測定藥物接觸。 最常用的活化系統(tǒng)是經(jīng)誘導酶介質處理的，從嚙齒類動物肝臟制備的 cofactor-supplemented post-motochondrial fraction。所用的誘導酶介質 如Aroclorl254 (6) (7) (8) (9)獲苯巴比酮與僚黃酮(10) (11)( 12 )的混合物。在最終的測定媒介中，末段線粒體片段常被應用于濃度范圍110%v/v 之間。代謝活化系統(tǒng)的條件決定于被測定的化學物質。在某些情況下， 可以

7、不止一種末段線粒體濃度被選用。數(shù)目的增長，包括能表達特殊活化作用的酶的經(jīng)遺傳得到的功能性細 胞的構造，可以提供潛在的內(nèi)部活化作用。應按科學的方法調(diào)整對細 胞列的選擇(如根據(jù)細胞色素P450同功能酶對測定物的新陳代謝的適 應度)。1.4.1.5. 測定物質/準備 固體測定物質應該在合適的溶劑或媒介物中被溶解或形成懸濁液，如 果高于細胞處理濃度應進行稀釋。液體測定物可直接加入測定體系或 稀釋到高于處理濃度。測定物應是新鮮制成的，除非有確切的實驗數(shù) 據(jù)證明儲存物的可用性。1.4.2. 測定條件1.4.2.1. 溶劑/媒介物溶劑/媒介物不應該與待測物發(fā)生化學反應，并與細胞的存活和S9的 活動相協(xié)調(diào)。若

8、選用的不是常用的溶劑或媒介物，其成分要有具體的 數(shù)字表明其的可用性。能用水作溶劑或媒介物的，應首先考慮水。當 測定的是對水不穩(wěn)定的物質時，應首先考慮有機溶劑或媒介物?？捎?分子篩除去水。1.4.2.2. 暴漏濃度在決定最高濃度時，應對標準中的細胞毒素，在測定系統(tǒng)中的溶解度，PH值的改變或同滲重摩效應進行考慮。在用細胞完整性和成長程度作為表征的主要實驗中，細胞的毒性，需 要由在代謝活化作用和無代謝活化作用下的實驗數(shù)據(jù)共同確定。如細 胞合并的程度，成活細胞數(shù)，或有絲分裂指數(shù)。它對于初步實驗中細 胞毒性和溶解性的確定是非常有用的。至少應選用三種測定濃度。在產(chǎn)生細胞毒素的地方，濃度范圍應從產(chǎn) 生最大毒

9、性到產(chǎn)生最小或不產(chǎn)生毒性。這常意味著各濃度間相差從2 到目0間的一個值。在收集觀測細胞時，最高濃度的測定條件在細胞的合并程度、細胞數(shù)、 有絲分裂指數(shù)上表現(xiàn)出明顯的降低（降低幅度大于 50%）。有絲分裂 指數(shù)是對細胞毒素效應/細胞抑制效應的間接測量實驗數(shù)據(jù)，它決定 于處理后的時間。但是，對于其它毒性測定方法較麻煩或不可行的懸 濁液體系，有絲分裂指數(shù)是適用的。有關細胞循環(huán)動力學的實驗數(shù)據(jù)， 如平均產(chǎn)生時間（AGT）,能夠被用作補充信息。但AGT僅僅是總體 的平均值，不能揭示延遲產(chǎn)生的細胞的存在，并且其微小的變化不能 與細胞最佳異變時間的延遲相聯(lián)系。對于相關的無毒性物質，最大測定濃度是5“l(fā)/ml最

10、低測定濃度是 5mg/m 1,或 0.01M。對于相關的不溶物，比不溶濃度低的濃度無毒性，所選用的最高級量 應比處理末期其在最后媒介物中的溶解度高。在某些情況下（如僅僅 在比最低不溶濃度高時產(chǎn)生毒性）,應該在不止一種濃度下進行測定。 在處理之初和結束時估計溶解度是有用的，因為由于細胞，S9,血清 等的存在會使?jié)舛仍跍y定系統(tǒng)接觸于空氣的過程中發(fā)生改變。肉眼即 可觀測到不溶現(xiàn)象。沉淀物不應干擾實驗數(shù)據(jù)。1.4.2.3. 陰性和陽性對照并發(fā)的陽性和陰性（溶劑或媒質）對照，既要在存在代謝活性又要在 不存在代謝活性的條件下進行，每一次實驗都要采用。當代謝活性系 統(tǒng)被運用時，陽性對照化學物質應該是要求活化

11、才能產(chǎn)生誘導有機體 突變物質的。陽性對照應借助于已知的斷裂劑，再接觸的水平上有望在支配測定系 統(tǒng)靈敏度的背景下產(chǎn)生明顯的增長。應選擇陽性對照濃度，從而得到清晰的效果又不直接向讀者揭示編碼變化的特性。陽性對照物的例子包括：新陳代謝活化條件物質CAS NO.EINECS NO.無外部代謝活化系統(tǒng)甲基磺酸鹽66-27-3200-625-0乙基磺酸鹽62-50-0200-536-7乙基亞硝基脲759-73-9212-072-2絲裂霉素C50-07-7200-008-6N-氧化物-4-硝基喹啉56-57-5200-281-1存在外加代謝活化系統(tǒng)苯并芘50-32-8200-028-5環(huán)磷酰胺50-18-0

12、200-015-4環(huán)環(huán)磷酰胺一水化物6055-19-2其他適合的陽性對照物也可使用?；瘜W等級的陽性對照物如果有效， 也可考慮。陰性對照，由單獨的溶劑和媒介物形成的實驗介質，要和實驗培養(yǎng)基 一樣處理，每次收集時都應包括在內(nèi)。此外，未處理對照也應當被使 用，除非控制過程的歷史實驗數(shù)據(jù)表明所選溶劑無毒副作用，也不會 發(fā)生任何突變。1.4.3. 實驗步驟1.4.3.1. 測定物處理在新陳代謝活化系統(tǒng)存在和不存在情況下，分別以測定物對增殖細胞 作用。刺激有絲分裂后約48小時開始淋巴細胞測定。1.4.3.2. 在不同濃度培養(yǎng)基下重復培養(yǎng)。強烈建議使用逆向溶劑控 制。能證實兩次重復培養(yǎng)之間的歷史實驗數(shù)據(jù)的變

13、化最小變 化（13）（14），其他的適當陽性的對照物質可能被用?；瘜W 藥品應該被考慮的陽性對照,當可得的.此實驗數(shù)據(jù)即可用于 各濃度的單次培養(yǎng)。氣態(tài)或揮發(fā)性物質應采用適當方式測定，如在密封的培養(yǎng)皿中進行（15）（16）。1.4.3.3. 培養(yǎng)物收集時間 在第一個實驗中，無論有無新陳代謝活性，細胞均應接觸在測定物中 36小時。實驗開始后（12），每個約1.5個正常細胞周期取一次樣。 如果在有無活化劑的情況下，取樣結果都是逆向的，就需要在無活化 的條件下再做一次。連續(xù)處理直至取樣周期等于1.5個正常細胞周期。 某些物質更容易在處理/取樣周期長于1.5個細胞周期是被測定出來。 新陳代謝活化條件下的逆

14、向結果應在各次測定結果上加以證實。在無 必要進行逆向測定結果確定的情況下，應給出正當?shù)睦碛伞?.4.3.4. 染色體的準備有秋水仙素或秋水酰胺處理的細胞培養(yǎng)物一般在13小時即可收集。 為了準備染色體，每份細胞培養(yǎng)物應單獨收集、處理。染色體的處理 包括細胞低滲處理、固定、染色。1.4.3.5. 分析所有的固定切片包括陽性和陰性對照，都應該在顯微鏡分析前進行獨 立的分析。因為固定的過程，經(jīng)常帶來一定量的中期細胞的分裂和染 色體的喪失。標記的細胞因包含很多中心小體，數(shù)目幾乎與所有細胞 類型樣式數(shù) 2 相當。至少每單位濃度和對照的200個好的細胞經(jīng)過中 期是應被標記；如果正確的話，能被所有復制品均勻的

15、分開。當更多 的異變發(fā)生時，這個數(shù)目會下降。盡管測定目的是測定結構性染色體 變異，如果細胞內(nèi)發(fā)生多倍體復制現(xiàn)象，進行記錄也是很重要的。2. 實驗數(shù)據(jù)2.1.結果的處理測定的單位是細胞，因而應該評估發(fā)生結構性染色體變異的細胞的比 率。不同類型的結構性染色體變異應同時列出數(shù)目、實驗頻率、對照 培養(yǎng)品。裂縫應單獨記錄，一般不包括在總的變異頻率中。還應記錄所有陽性 和陰性對照中的培養(yǎng)物的細胞毒素量。應提供單個培養(yǎng)物的實驗數(shù)據(jù)。此外，所有實驗數(shù)據(jù)應以表格的形式 總結。沒有必要對一個清晰的陽性反應進行證明。不確定的結果將在以后的 實驗中通過精確的改善實驗條件而被證實。陰性結果證明的必要性已 經(jīng)在1.4.3

16、.3中討論過了。擴大確定條件的分類而對研究參數(shù)的糾正應 該在隨后的實驗中考慮。應該糾正的研究參數(shù)包括濃度、時間間隔、 新陳代謝活化條件。2.2. 結果評價與分析這里有許多確定的陽性結果的標準，向相關的濃度增加或帶有染色體 變異的細胞數(shù)目的復制性增加。應首先考慮生化關系。統(tǒng)計學方法被 用來評估測定結果(3) (B)。但統(tǒng)計學的意義不應該作為判斷陽性 結果的唯一因素。多倍體細胞數(shù)目的增加可以表明測定物質有抑制有絲分裂和引發(fā)級 數(shù)式染色體變異的潛能。細胞內(nèi)染色體復制的細胞數(shù)目的增加，可以 證明實驗物質有抑制細胞循環(huán)進行的潛能（17）（18）。在這一個系統(tǒng)中，結果不符合上述的標準測定物質被認為是非誘導

17、有 機體突變的物質。雖然大多數(shù)的實驗將會給出清楚的陽性的或陰性的結果 , 但在極少 的情況下數(shù)據(jù)將不能對所測定物質的活性做出明確的判斷。 無論測 定重復進行了多少次，結果仍保持意義不明確的或可疑的。染色體變異測定中陽性的結果指出測定物質導致人工培育的哺乳動 物的體細胞內(nèi)染色體結構變異。 陰性的結果指出,在測定情況之下， 測定物質不導致人工培育的哺乳動物的體細胞內(nèi)的染色體變異。3. 實驗結果報告測定結果報告測定結果報告必需包括下列各項信息:溶劑/ 媒介物:-選擇媒介物的理有;-測定物質在溶劑或媒介物中的可溶性和穩(wěn)定性,如果已知;細胞:-細胞的類型和來源;被用細胞的染色體類型特征和合適性;-沒有支

18、原體，如果適用;-細胞的周期長短的信息：-被采血者的性別 , 全血或分開的淋巴細胞，使用的有絲分裂原-各種方法的數(shù)量, 如果使用;-細胞培養(yǎng)基的保養(yǎng)方法, 如果使用 ;-染色體類型的數(shù)目。測定條件 :-中期發(fā)現(xiàn)物質的識別特征，它的密度和細胞接觸的忍耐力;-選擇密度和所涉生物物種的數(shù)據(jù)，例如：細胞毒性的數(shù)據(jù)和可溶性限制, 如果可得的;-培養(yǎng)基的結構 , 二氧化碳的集中度，如果可得;-測定物質的集中度;-媒介物和所加的測定物質的量;-孵化溫度;-孵化時間;-持續(xù)處理;在播物種的細胞密度, 如果合適的;-變化的活動系統(tǒng)的類型和組成, 包括可接受標準;-陽性的和陰性的對照組;-準備膠片的方法;-變異的

19、標準 ;-數(shù)字分析;-毒性測量的方法;-判斷研究是陽性的或陰性的標準；結果;-毒性的標志，例如交流匯合的程度，細胞周期的數(shù)據(jù)，細胞計數(shù)，有絲分裂;-沉淀的標志；-在pH和處理介質上的數(shù)據(jù)，如果可決定的；-變異的定義，包括縫隙；-染色體變異的細胞的數(shù)目和染色體變異的類型，這些根據(jù)對照組的物種類的不同分開來給出；-倍性的變化，如果可以看到；-劑量回應的關系，在可能的地方；-如果有，就進行統(tǒng)計分析;-并發(fā)事件陰性(溶劑/媒介物)和陽性對照數(shù)據(jù)；-歷史上的陰性(溶劑/媒介物)和陽性的對照組數(shù)據(jù)，藉由范圍和方 法和標準偏差。結果的討論。結論。4. 參考文獻Evans, H.J. (1976). Cyto

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