受體的放射分析核醫(yī)學(xué)與核藥學(xué)教學(xué)、學(xué)習(xí)課件

1、受體的放射分析核醫(yī)學(xué)與核藥學(xué)教學(xué)、學(xué)習(xí)課件受體的放射分析核醫(yī)學(xué)與核藥學(xué)教學(xué)、學(xué)習(xí)課件 1. 概 論 受體:細(xì)胞表面或亞細(xì)胞組分中的一種分子，可以識別并特異地與有生物活性的化學(xué)信號物質(zhì)（配基）結(jié)合，從而激活或啟動一系列生化反應(yīng)，最后導(dǎo)致該信號物質(zhì)特定的生物效應(yīng)。迄今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的受體都是具有特定氨基酸序列和特定構(gòu)型的蛋白質(zhì)。每一種受體在細(xì)胞上都有特定的宏觀分布和微觀分布。 1. 概 論 一、受體功能（1）識別特異的信號物質(zhì)-配基，識別的表現(xiàn)在于兩者的特異結(jié)合。（2）把識別和接受的信號準(zhǔn)確無誤的放大并傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，同時啟動一系列胞內(nèi)生化反應(yīng)，最后導(dǎo)致特定的細(xì)胞反應(yīng)， 使得胞間信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信

2、號。一、受體功能（1）識別特異的信號物質(zhì)-配基，識別的表現(xiàn)在于二、受體的分類:1、膜受體 跨膜 2、核受體 細(xì)胞內(nèi)二、受體的分類:1、膜受體 跨膜 2、核受體 細(xì)胞內(nèi)受體的亞型：指受體分子結(jié)構(gòu)上既有部分相同之處，也存在部分差別，它們對一定的配基有不同的親和力，在生物學(xué)上具有各自不同的效應(yīng)。受體亞型的區(qū)分是生物進(jìn)化的結(jié)果，有利于機體處理信息的能力及適應(yīng)性更強。受體數(shù)量：占細(xì)胞蛋白總量十萬之一到百萬分之一（一個細(xì)胞上僅有數(shù)千個受體分子），一般方法難以分離和測定受體分子。 受體的亞型：指受體分子結(jié)構(gòu)上既有部分相同之處，也存在部分差別配體：是指能和受體結(jié)合并引起相關(guān)效應(yīng)的化合物。除了與受體結(jié)合外本身并

3、無其他功能，它不能參加代謝產(chǎn)生有用產(chǎn)物，也不直接誘導(dǎo)任何細(xì)胞活性，更無酶的特點，它唯一的功能就是通知細(xì)胞在環(huán)境中存在一種特殊信號或刺激因素。配體：是指能和受體結(jié)合并引起相關(guān)效應(yīng)的化合物。除了與受體結(jié)合 配體與受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它靠氫鍵、離子鍵與范德華力的作用，隨著兩種分子空間結(jié)構(gòu)互補程度增加，相互作用基團(tuán)之間距離就會縮短，作用力就會大大增加，因此分子空間結(jié)構(gòu)的互補性是特異結(jié)合的主要因素。 同一配體可能有兩種或兩種以上的不同受體，例如乙酰膽堿有煙堿型和毒蕈型兩種受體，同一配體與不同類型受體結(jié)合會產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng)。如 Ach可以使骨骼肌興奮，但對心肌則是抑制的。配基可以是神經(jīng)遞質(zhì)、激

4、素、某些藥物等。 配體與受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它靠氫鍵三、跨膜受體的信號傳遞通路 跨膜受體是含糖或不含糖的蛋白質(zhì)分子，它的主要作用是將細(xì)胞外的信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，信號再從細(xì)胞漿傳遞到效應(yīng)器，最后是一個特定的生物學(xué)效應(yīng)。信號的這種傳導(dǎo)過程稱為信號傳導(dǎo)通路（signal transudation pathway），它是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域中一個重大的研究課題。三、跨膜受體的信號傳遞通路四、受體與配基結(jié)合的特性 1、可飽和性（satiability）：受體結(jié)合反應(yīng)呈高親和性和低容量，而非特異結(jié)合則呈低親和性和高容量，后者的劑量反應(yīng)曲線不呈可飽和性。2、可逆性（reversibility）：激素、遞質(zhì)

5、和藥物與特異性受體結(jié)合反應(yīng)是可逆的，當(dāng)受體周圍的配基濃度降低，結(jié)合反應(yīng)就逆向進(jìn)行，即配基受體復(fù)合物很快解離，解離后的配基是原形，不起代謝變化，這跟酶與底物作用結(jié)果不同，底物經(jīng)酶作用后變成代謝產(chǎn)物。 四、受體與配基結(jié)合的特性 1、可飽和性（satiabilit3、特異性和親和性 受體具有特異識別配基的性能，因此只有嚴(yán)格構(gòu)型和構(gòu)象的配基分子才能選擇性地與受體結(jié)合。受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織（靶器官）的專一性上，如雌激素對子宮、陰道、乳腺等器官有興奮作用，這是因為這些器官上雌激素受體的數(shù)量明顯高于非靶器官。受體的親和性是指受體和配基的結(jié)合能力，受體親和性高就說明受體和配基結(jié)合的牢固，不容易解離。

6、3、特異性和親和性4、與效應(yīng)的一致性 受體的主要功能是介導(dǎo)配基的生物效應(yīng)，如果一種蛋白能與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導(dǎo)特定的生物效應(yīng)，那么這種蛋白不能稱之為受體。所以用生物效應(yīng)作為觀察受體和配基性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是十分必要的。從配基的角度分析，有的是陽性效應(yīng)，有的是陰性效應(yīng)。陽性效應(yīng)就是配基與受體結(jié)合后引起陽性生理效應(yīng)，稱為激動劑。陰性效應(yīng)就是配基與受體結(jié)合后不但不引起陽性生理效應(yīng)，而且阻斷內(nèi)源性配基的陽性生理作用，稱為拮抗劑或阻斷劑。 4、與效應(yīng)的一致性 五、受體的生理調(diào)節(jié) 正常生理狀態(tài)下的受體處在一個不斷合成與降解的動態(tài)平衡中，但其數(shù)量和親和性也會因疾病、藥物作用而發(fā)生變化。1、向下調(diào)節(jié)（down-reg

7、ulation） 細(xì)胞所處環(huán)境中某種激動劑的濃度增高或長期作用，其結(jié)果使相應(yīng)受體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)受體對此物質(zhì)的敏感性下降，或耐受性增高等現(xiàn)象，如哮喘病人長期服用-激動劑產(chǎn)生的耐受性增高，即藥效減弱。 五、受體的生理調(diào)節(jié) 正常生理狀態(tài)下的受體處2、向上調(diào)節(jié)（up-regulation） 細(xì)胞所處環(huán)境中某種拮抗劑的濃度過高或長期作用，結(jié)果會使受體數(shù)量增高，出現(xiàn)受體敏感性增高，表現(xiàn)為增敏，或撤藥后反跳現(xiàn)象。如高血壓病人長期服用心得安時對兒茶酚胺增敏，若突然停藥，可出現(xiàn)血壓升高的反跳現(xiàn)象。由于受體在整體條件下，隨機體狀態(tài)變化，會出現(xiàn)生理調(diào)節(jié)，因此對受體數(shù)量和親和性測定就成為研究病理變化和評價藥效的重

8、要內(nèi)容。 2、向上調(diào)節(jié)（up-regulation）六、受體與疾病遺傳缺陷與免疫異常為受體性疾病的常見原因 1、基因突變致使受體異常，引發(fā)功能障礙，絕大多數(shù)是功能降低或完全喪失，有家族史，病情嚴(yán)重。如睪酮受體基因突變致該受體缺陷引起睪丸完全雌性化病。2、機體對受體產(chǎn)生自身抗體，激動（如Graves綜合癥患者產(chǎn)生TSH受體抗體，直接持續(xù)激動甲狀腺TSH受體）或阻斷（如重癥肌無力患者產(chǎn)生N-Ach受體抗體，占領(lǐng)但不記得受體）受體。3、某些病有受體異常，非原始發(fā)病環(huán)節(jié)，為發(fā)病重要環(huán)節(jié)，采取針對措施可控制病情。甲亢用腎上腺素阻斷劑，哮喘用腎上腺素激動劑。4、受體與腫瘤：激素受體在腫瘤中存在與否決定治療

9、方案（乳腺癌 白血?。?；某些受體基因可突變成為癌基因，引發(fā)腫瘤。六、受體與疾病遺傳缺陷與免疫異常為受體性疾病的常見原因 2.受體配基結(jié)合反應(yīng)的基本原理 RBA的基本原理與IRMA基本相同，應(yīng)用放射性標(biāo)記配體，在一定條件下與受體（R）結(jié)合成配體與受體復(fù)合物（R*L），分離并測定R*L的放射性，然后經(jīng)數(shù)據(jù)處理，可測得受體的親和力和受體的數(shù)量。2.受體配基結(jié)合反應(yīng)的基本原理 RBA的基本原理一、受體與配基相互結(jié)合的基本規(guī)律（一）質(zhì)量作用定律（mass action law） 簡單單位點系統(tǒng)：指對某種受體而言，它的全部受體都以相同的親和性以單分子與特定的配基相結(jié)合，而且不表現(xiàn)明顯的正負(fù)協(xié)同作用，理論上

10、講結(jié)合后產(chǎn)生的生物效應(yīng)也應(yīng)完全相同。這種系統(tǒng)稱之為。 有時，一個受體系統(tǒng)中存在兩（多）種亞型，但所用配基無選擇性，盡管亞型的生物效應(yīng)可能不全相同，結(jié)合反應(yīng)卻表現(xiàn)出完全相同的特征，這時，也可作為單位點系統(tǒng)來看待。一、受體與配基相互結(jié)合的基本規(guī)律受體的放射分析核醫(yī)學(xué)與核藥學(xué)教學(xué)、學(xué)習(xí)課件（二）復(fù)合物的濃度和配基濃度的關(guān)系： 可以看出，RL和LT 并非線性關(guān)系，而是曲線關(guān)系，對一定數(shù)量（RT固定）和一定親和力（KD固定）的受體來說，配基濃度從零開始上升時，復(fù)合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大多數(shù)受體都變?yōu)閺?fù)合物，也就是受體被飽和了。這就是飽和曲線 （saturation curve)（圖9

11、1）。 （二）復(fù)合物的濃度和配基濃度的關(guān)系： 可以曲線的高度主要反映受體的數(shù)量多少，曲線上升的快慢則主要反映受體和配基的親和力。 曲線的高度主要反映受體的數(shù)量多少，曲線上升的快慢則主要反映受（三）非特異結(jié)合（non-specific binding，NSB） 上述飽和曲線是受體與配基的特異結(jié)合形成的。這種結(jié)合的特點是低容量和高親和力，所以容易飽和。但是，任何受體標(biāo)本除特異結(jié)合外，還會有一部分非特異結(jié)合，當(dāng)分離特異結(jié)合的復(fù)合物測量放射性時，這部分非特異結(jié)合的放射性混在一起，測到的是總放射性（total binding，TB），必需先減去非特異結(jié)合（NSB），才能得到特異結(jié)合（specific b

12、inding，SB）的放射性。 （三）非特異結(jié)合（non-specific binding， NSB主要來自雜蛋白，反應(yīng)器壁，分離材料的吸附，它的特點是，容量很大，而親和力低，因此在一般情況下不被飽和，也就是隨著配基濃度的升高，它不呈飽和曲線，而是一條上升的直線（圖9l）。另外，如果系統(tǒng)中存在大量同種受體的非標(biāo)記配基，則放射性的SB被非標(biāo)記配基取代，而NSB由于容量很大，空余的位點很多，放射性不被取代。所以要從TB中減去NSB，最基本的辦法是做一系列平行管，所有的條件都與 TB管相同，只是多加 1001000倍量的非標(biāo)記配基，將SB完全取代掉，這時的放射性結(jié)合即為NSB。由于NSB和放射配基呈

13、直線關(guān)系，多點飽和法的實驗中往往只需做34點，再用直線回歸法求出其余各點的放射性。 NSB主要來自雜蛋白，反應(yīng)器壁，分離材料的吸（四）正負(fù)協(xié)同作用 當(dāng)一部分受體與配基結(jié)合后使相鄰的受體的親和力發(fā)生改變，倘若親和力逐步下降，稱之為負(fù)協(xié)同作用如曲線（2） ，親和力逐步增大，稱之為正協(xié)同作用如曲線（3）。 （四）正負(fù)協(xié)同作用 當(dāng)一部分受體與配基結(jié)合后使相鄰的受（五）受體與配基反應(yīng)的動力學(xué)（kinetics） 受體與配基的結(jié)合反應(yīng)一般都較快（多數(shù)在數(shù)十秒至數(shù)十分鐘）達(dá)到平衡。當(dāng)周圍的游離配基急劇下降，或非標(biāo)記配基濃度急劇升高時，放射性復(fù)合物的解離也很快，這種快速結(jié)合和快速解離對保證受體的迅速反應(yīng)有很重

14、要的意義。（五）受體與配基反應(yīng)的動力學(xué)（kinetics） （六）競爭性取代反應(yīng) 在一個受體和放射配基的反應(yīng)系統(tǒng)中加入另一個化合物，它若能和受體的結(jié)合位點結(jié)合，則會與放射配基競爭與受體結(jié)合，最終將表現(xiàn)為放射配基與受體形成復(fù)合物的能力降低，但受體數(shù)量不變,所以叫競爭性取代反應(yīng)。此時，非標(biāo)記的起競爭作用的配基稱為競爭劑,它們和受體結(jié)合后不改變受體分子的結(jié)構(gòu)。（六）競爭性取代反應(yīng) 表示競爭劑抑制作用強弱的指標(biāo)有二個：IC50值和KI。IC50值是指抑制50受體與放射配基結(jié)合所需競爭劑的濃度，IC50值大，表明競爭劑抑制作用小。KI則是指競爭劑的平衡解離常數(shù)，KI越小，表明競爭劑抑制作用越大。 二、雙

15、（多）位點系統(tǒng) 一種配基可以和兩種以上的受體亞型結(jié)合，每種亞型都有相應(yīng)的KD值（自學(xué)）。 表示競爭劑抑制作用強弱的指標(biāo)有二個：IC50值和KI。3. 受體放射分析的基本方法 離體RBA基本方法的流程為： 3. 受體放射分析的基本方法 離體RBA基本方法一、放射性配基的要求 制備優(yōu)良的放射性配基是受體結(jié)合試驗的首要條件。對任何一種受體系統(tǒng)，通常都有好幾種標(biāo)記配基可供選擇。選擇應(yīng)從兩方面考慮：配基的特性；實驗?zāi)康摹?（一）對放射性配基的基本要求1、高比活度：組織細(xì)胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約104-105個/細(xì)胞，或0.01-3.0 pmol/mg蛋白的水平，低比活度的配基難于達(dá)到分析靈敏度的要求

16、。 一、放射性配基的要求 一般要求配基比活度至少在3.71011Bq（10Ci）mmol以上。另外，配基比活度高，加入反應(yīng)管的放射性配基量才有可能減少，從而有利于用小量標(biāo)本得到可靠的數(shù)據(jù)，并有利降低非特異性結(jié)合率。2、高親和力:親和力高，可以減少標(biāo)記配基用量，從而既可降低非特異性結(jié)合，又可使放射性配基與受體的結(jié)合物解離變慢，便于進(jìn)行結(jié)合和游離配基的分離。不僅方便操作，而且獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。 一般要求配基比活度至少在3.71011Bq（10C3、特異性強:即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，理想的是該配基只與一種受體或受體亞型結(jié)合。但沒有一種配基是完全選擇性的，所以要結(jié)合實驗研究的目的，選擇對某一受

17、體或其中某一亞型親和力高的放射性配基。4、高的穩(wěn)定性及放化純度:包括標(biāo)記的穩(wěn)定性、貯藏時的穩(wěn)定性以及溫育分析時之穩(wěn)定性,同時具有95%以上的放化純度。 總的來說,配基的選擇要根據(jù)實驗?zāi)縼矶ā?、特異性強:即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，理想的是該配 目前，用作受體放射分析的放射性配基多用3H、125I標(biāo)記。 3H標(biāo)記配基與原型配基為同型式，生物學(xué)活性好，多數(shù)情況下比活度也能達(dá)到要求，且半衰期長，使用方便，主要缺點是需用液閃測量，操作較麻煩，一般實驗室不能進(jìn)行標(biāo)記。多肽及蛋白質(zhì)配基多用125I標(biāo)記，其優(yōu)點是可以達(dá)到較高的比活度。只要很好掌握標(biāo)記條件，仍能保持較好的生物活性。另外，碘標(biāo)記法快速、

18、方便、經(jīng)濟，一般實驗室可進(jìn)行。 目前，用作受體放射分析的放射性配基多用3H、（二）放射性配基的質(zhì)量鑒定 1、放射化學(xué)純度: 除新鮮產(chǎn)品外,存放一定時間后的標(biāo)記配基均應(yīng)重測其放化純度，以保證分析的準(zhǔn)確性。一般要求放化純度應(yīng)在95以上。 2、結(jié)合活性鑒定 3、比活度：受體結(jié)合分析的結(jié)果計算離不開準(zhǔn)確的比活度數(shù)據(jù)。（二）放射性配基的質(zhì)量鑒定 二、受體標(biāo)本的制備 在受體結(jié)合實驗的研究中，所用的受體材料可以是組織切片，也可以是完整的單層培養(yǎng)細(xì)胞或游離活細(xì)胞，粗制的或純化的細(xì)胞膜受體，可溶性的受體蛋白等。 （一）組織切片 冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中與標(biāo)記配基進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后用緩沖液洗

19、幾次即可，切片厚度一般為5-50m。用組織切片的目的更多是研究受體的分布（用放射自顯影法或免疫組化）。 二、受體標(biāo)本的制備 （一）組織切片（二）游離的完整細(xì)胞懸液 完整的活細(xì)胞可以是血細(xì)胞，培養(yǎng)的單層細(xì)胞，腫瘤的腹水型細(xì)胞以及經(jīng)處理的原代細(xì)胞等，使用完整細(xì)胞的優(yōu)點：1、受體處于原有的正常環(huán)境中。膜未受擾亂，膜內(nèi)pH、離子梯度也保存著。受體與其相連的效應(yīng)系統(tǒng)（如G蛋白）也保存完好。2、在受體功能反應(yīng)完全的情況下研究受體，可以同時觀察配基與受體結(jié)合的情況和細(xì)胞的生物效應(yīng)。所得的結(jié)果更能反映受體的生理特點。3、能直接給出平均每一個細(xì)胞的受體數(shù)。 （二）游離的完整細(xì)胞懸液 但完整細(xì)胞的受體分析較難控制

20、分析條件。操作過程可能導(dǎo)致細(xì)胞表面生理活性的改變，因此結(jié)果有時不夠穩(wěn)定。另外，若細(xì)胞上某種受體的含量低，作分析時需加入大量細(xì)胞才能獲得足夠的放射性計數(shù)，給實際工作帶來一定困難。完整細(xì)胞來源分三種：從組織分離出游離細(xì)胞；血細(xì)胞；培養(yǎng)細(xì)胞。一般都需采用臺盼藍(lán)等檢查細(xì)胞活性。 但完整細(xì)胞的受體分析較難控制分析條件。操（三）膜制劑（membranous preparation） 絕大多數(shù)受體結(jié)合分析使用膜制劑。使用膜制劑可以減少非特異性結(jié)合率。而且，在膜制備過程中，通過洗膜的方法，可以將內(nèi)源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。膜制劑通常也保存有受體-效應(yīng)器結(jié)合系統(tǒng)。但受體功能的其他方面則失去了。另外，膜

21、內(nèi)離子濃度梯度、受體與細(xì)胞結(jié)構(gòu)關(guān)系也失去了。但是，受體結(jié)合需要的是膜雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)本身，而不是細(xì)胞內(nèi)其他組份。所以膜碎片內(nèi)仍保留受體的藥理學(xué)特性。（三）膜制劑（membranous preparation） 細(xì)胞膜和細(xì)胞漿受體的制備一般都利用蔗糖密度（0.250.3molL）梯度離心法分離不同的亞細(xì)胞組分。其優(yōu)點是除去大部分雜蛋白，以減小非特異結(jié)合。為保證所制得的膜受體保持良好的結(jié)合活性，需注意：全部過程在0-4下進(jìn)行操作。制備緩沖液的蔗糖密度，離子強度，pH值及其它物質(zhì)（如 EDTA，Mg2）應(yīng)嚴(yán)格控制。組織勻漿條件應(yīng)保持一致。離心的時間、速度、溫度應(yīng)保持恒定。為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加

22、蛋白酶抑制劑。 細(xì)胞膜和細(xì)胞漿受體的制備一般都利用蔗糖密度（ 細(xì)胞組份的分離一般采用差速離心法。通過適當(dāng)控制離心力及離心時間可使某些顆粒組份沉淀，而另一些保留在上清液中。細(xì)胞組份的一般分離流程如下： 細(xì)胞組份的分離一般采用差速離心法。通過適當(dāng)控制三、結(jié)合反應(yīng)的類型 （一）標(biāo)記配基飽和法1、單點飽和法：定量受體制劑加大量的標(biāo)記配基使受體得以飽和結(jié)合。根據(jù)受體-配基復(fù)合物的放射性計算受體結(jié)合容量（或結(jié)合位點數(shù)）。這種方法操作簡便、標(biāo)本用量少。但只憑單點實驗數(shù)據(jù)計算受體結(jié)合容量，比多點法的結(jié)果略低，不能給出KD，誤差也相對大些。 三、結(jié)合反應(yīng)的類型 2、多點飽和法：一定量的受體制劑，逐步增加標(biāo)記配基

23、的量（一般7-8個實驗點），使受體的結(jié)合趨于飽和。用曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力（RT、KD），結(jié)果可靠性高。但受體標(biāo)本、標(biāo)記配基用量大，工作量大。 2、多點飽和法：一定量的受體制劑，逐步增加標(biāo)記配基的量（一般（二）非標(biāo)記配基飽和法 一定量的受體制劑和標(biāo)記配基，逐漸增加非標(biāo)記配基（一般78個實驗點），使受體飽和結(jié)合，曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力。這種方法克服了多點飽和法標(biāo)記配基用量大的缺點，但由于非標(biāo)記配基的用量逐漸加大，放射性逐步減少，必需標(biāo)記配基比活度較高才能得到滿意結(jié)果。 （二）非標(biāo)記配基飽和法 四、分析條件的選擇 （一）標(biāo)記配基濃度 （二）受體濃度 （三）溫育溫度與時間 （四）緩沖液 四、分析條件的選擇五、結(jié)合與游離配基的分離 受體-配基結(jié)合分析主要是測定反應(yīng)平衡時結(jié)合配基的量，求解受體的密度與平衡解離常數(shù)。反應(yīng)一般在達(dá)到平衡后先經(jīng)分離，再測結(jié)合部分的放射性。理論上，一經(jīng)分離，反應(yīng)的平衡就會被破壞，所以選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x方法和環(huán)境，使受體-配基復(fù)合物在分離過程中的解離減少到最低限度。低溫是降低解離的最有效手段，分離快慢也是重要因素。 常用的分離方法有離心法、濾膜法、吸附法、透析法、電泳法等。若復(fù)合物解離快，則只能選擇快速的分離方法。同時一定要在分離時間，分離溫度等方面保持各樣品管之間的一致性，以減少誤差。五、結(jié)合與游