基因測(cè)序的前世今生一代測(cè)序二代測(cè)序三代測(cè)序最詳原理

1、測(cè)序技術(shù)的前世今生 測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展歷程 第一代測(cè)序技術(shù)（ Sanger 測(cè)序 ） 第一代 DNA 測(cè)序技術(shù)用的是 1975 年由桑格（ Sanger）和考爾森（ Coulson）開(kāi)創(chuàng)的鏈終止法 或者是 1976-1977 年由馬克西姆（ Maxam ）和吉爾伯特（ Gilbert ）制造的化學(xué)法（鏈降解） ,在 2022 年,完成的首個(gè)人類(lèi)基因組圖譜就是以改進(jìn)了的 Sanger 法為其測(cè)序基礎(chǔ)； 原理： ddNTP的 3無(wú)羥基,其在 DNA 的合成過(guò)程中不能形成磷酸二酯鍵,因此可以用來(lái)中 斷 DNA 合成反應(yīng), 在 4 個(gè) DNA 合成反應(yīng)體系中分別加入確定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的 ddNT

2、P （分為： ddATP,ddCTP,ddGTP 和 確定待測(cè)分子的 DNA 序列； ddTTP）,通過(guò)凝膠電泳和放射自顯影后可以依據(jù)電泳帶的位置 其次代測(cè)序技術(shù) NGS第一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá) 1000bp ,精確性高達(dá) 99.999%,但其測(cè)序成本 高,通量低等方面的缺點(diǎn),嚴(yán)肅影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用；經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)開(kāi)發(fā)和改進(jìn),以 Roche 公司的 454 技術(shù), illumina 公司的 Solexa,Hiseq 技術(shù)和 ABI 公司的 Solid 技術(shù)為標(biāo)記的其次 代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生了； 其大大降低了測(cè)序成本的同時(shí), 仍大幅提高了測(cè)序速度, 并且保持了高精確 性,以前完成一

3、個(gè)人類(lèi)基因組的測(cè)序需要 3 年時(shí)間, 而使用二代測(cè)序技術(shù)就僅僅需要 1 周, 但在 序列讀長(zhǎng)方面比起第一代測(cè)序技術(shù)就要短很多, 1.illumina大多只有 100bp-150bp ； Illumina 公司的 Solexa 和 Hiseq 是目前全球使用量最大的其次代測(cè)序機(jī)器, 占全球 75%以上, 以 HiSeq 系列為主,技術(shù)核心原理都是邊合成邊測(cè)序的方法,測(cè)序過(guò)程主要分為以下 4 步： 第 2 頁(yè),共 5 頁(yè)1）構(gòu)建 DNA 測(cè)序文庫(kù) DNA 分子用超聲波打斷成 200bp-500bp 長(zhǎng)的序列片段,并在兩端添加上不同的接頭； 2）測(cè)序流淌槽（ flowcell ） 結(jié)構(gòu)： Flowc

4、ell 是測(cè)序的載體,課吸附 DNA 文庫(kù),每個(gè) flowcell 有 8 條 lane,每個(gè) lane 有 2 行 column ,每行 column 有 60 個(gè) tail ,每個(gè) tail 經(jīng) CCD 鏡頭課捕獲熒光信 號(hào)； 第 3 頁(yè),共 5 頁(yè)3）成簇（ cluster ） NGS 的核心技術(shù)特點(diǎn),目的在于實(shí)現(xiàn)將單一堿基的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行放大,以達(dá)到 CCD 鏡頭 攝 取熒光的信號(hào)要求；大體原理網(wǎng)上都可查到,在此解答 2 大難懂得之處： 一可逆終止熒光 dNTPIllumina 測(cè)序核心技術(shù) 熒光修飾 dNTP 可逆合成終止 （ 包括 用疊氮基團(tuán) 即起到了可逆終止作用和用不同熒光集團(tuán)區(qū)

5、別堿基信號(hào)的功能 ） ,是 Illumina 測(cè)序的最核心技術(shù)； 第 4 頁(yè),共 5 頁(yè)1. 上圖是修飾過(guò)的 dCTP 分子結(jié)構(gòu)式,在核苷酸糖基 3位連一個(gè)疊氮基團(tuán)（ 紅色基團(tuán) ）；這個(gè) 疊氮基團(tuán)在鏈延長(zhǎng)的時(shí)侯起到了 的 阻擋聚合 的作用（懂得見(jiàn)下圖 DNA復(fù)制時(shí)的 5和 3的示意圖, 下一個(gè)堿基合上時(shí)是： 下一個(gè)核苷酸的 5P 連接到上一個(gè)核苷酸的 3OH,故假如下一個(gè)核苷酸的 3帶有疊氮基團(tuán)而非自然狀態(tài)下的 OH 時(shí),下一個(gè)核苷酸就無(wú)法合上；） ； 2. 疊氮基團(tuán)有一個(gè)特性, 就是遇到巰基試劑 （例如： 二巰基丙醇） ,疊氮基團(tuán)會(huì)發(fā)生斷裂, 并在原先的位置留下一個(gè)羥基因此在熒光照相之后可以借此回復(fù) 合上； 3的 -OH 狀態(tài),以供下一個(gè)堿基 3. 在堿基上,通過(guò)連接臂（ 藍(lán)色基團(tuán) ）連接一個(gè)熒光基團(tuán)