兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)復(fù)合β－磷酸三鈣進(jìn)行胸椎后側(cè)融合實(shí)驗(yàn)

1、兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)復(fù)合磷酸三鈣進(jìn)展胸椎后側(cè)交融實(shí)驗(yàn)【關(guān)鍵詞】脊柱交融摘要：目的評(píng)價(jià)磷酸三鈣復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為骨移植替代物進(jìn)展脊柱交融的效果。方法60只兔子分四組進(jìn)展胸椎后路交融：組組織工程化骨即TP復(fù)合BSs，組TP自體紅骨髓，組單純TP，組自體髂骨。術(shù)后12周處死其余動(dòng)物進(jìn)展放射學(xué)、手工力學(xué)和組織學(xué)檢查。結(jié)果從影像學(xué)和手工力學(xué)比擬，組的交融率高于、組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織學(xué)上，組新骨形成量較多，陶瓷微孔內(nèi)部充滿新生骨;組骨小梁形成量較組少,為新生骨與纖維組織混雜；組陶瓷骨顆粒微孔內(nèi)多為結(jié)締組織，新生骨的量少，只見少量新生骨貼附于陶瓷骨外表;組在椎板與移植骨的交界處有稀疏的新生骨小梁形成

2、。結(jié)論TP復(fù)合BSs是脊柱交融自體骨的良好替代物。關(guān)鍵詞：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；磷酸三鈣；脊柱交融；骨移植替代物BnearrstralderivedsteblastsprustrialiuphsphatepsitesasbnegraftsubstitutefrpsterirthraispinalfusinAbstrat：bjetiveTevaluatetheeffiayfautgenusbnearrstralderivedsteblastsprus(BSs)trialiuphsphate(TP)psitesasanalternativetautgenusgraftaterialsinspinalfu

3、sin.ethdPsterirthraispinefusinasarriedutin60hiteNeZealandrabbitsusingnefthefllinggraftaterials:TPgranulesplusulturedSs(grup);TPgranulesplusfreshautgenusbnearr(grup);TPgranulesalne(grup);andautgenusbnegraft(grup).Alltherabbitserekilled12eeksaftersurgerytevaluateithradigraphy,T,anualpalpatinandhistlgi

4、analysis.ResultTherateffusinassignifiantlyhigheringrupparedithgrup,grupandgrup;IngrupIhistlgialanalysisshedabundanenelyfredbneinntatiththeiplantedgranules;Ingrupthereereareduedauntfnelyfredbneandabundantfibrustissue;Ingrupthereererelativelylittlenebnefratinandabundantfibrustissue;Ingrup,thereerethin

5、trabeulaefnelyfredbnelsedtthedertiatedlainaandsefibrustissue.nlusinTheresultsindiatethatbnearrstralderivedsteblastTPpsitesayprvideanellalternativetautgenusgraftaterialsfrspinalfusin.Keyrds：Bnearrstralell;trialiuphsphate;Spinalfusin;Bnegraftsubstitutes脊柱交融材料的研制及生物學(xué)因素在脊柱交融的過程中所起的作用已引起廣泛重視，本實(shí)驗(yàn)討論應(yīng)用多孔陶瓷磷

6、酸三鈣TP，上海貝奧路生物材料公司復(fù)合培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BSs)進(jìn)展脊柱交融，以期到達(dá)良好的脊柱交融率，尋找更理想的脊柱交融骨移植替代材料。1材料和方法1.1骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化將穿刺抽取的兔骨髓細(xì)胞液在1h內(nèi)進(jìn)展接種培養(yǎng)。按3105/2的密度接種于DE液培養(yǎng)瓶中，于37，5%2培養(yǎng)，5d后換液，去除未貼壁細(xì)胞，參加含成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液的DE培養(yǎng)基進(jìn)展誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。以后每隔3d換液。細(xì)胞生長達(dá)交融8090后，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)展消化，計(jì)數(shù)。按134進(jìn)展細(xì)胞傳代。搜集第三代細(xì)胞備用。1.2載體TP的準(zhǔn)備將TP人工骨制備成53大小，用三蒸水在超聲清洗機(jī)上反復(fù)清洗，洗凈

7、其外表及孔隙中的碎屑，枯燥后環(huán)氧乙烷消毒無菌包裝備用。1.3組織工程骨的構(gòu)建將TP人工骨顆粒浸在纖維連接蛋白100g/l溶液中，4條件下放置16h；然后換成DE培養(yǎng)基，并取傳第三代的骨細(xì)胞，以510106/l的濃度與TP混合，在37，5%2培養(yǎng)條件下用搖床動(dòng)態(tài)培養(yǎng)24h，其中復(fù)合培養(yǎng)12h換液1次。然后同等條件下改靜態(tài)培養(yǎng)，體外培養(yǎng)35d。制備組織工程化人工骨復(fù)合物。1.4脊柱交融動(dòng)物分組和手術(shù)方法1.4.1動(dòng)物分組60只兔子分4組進(jìn)展胸椎后路交融：組組織工程化骨即TP復(fù)合BSs，組TP自體紅骨髓，組單純TP，組自體髂骨。將擬植入的TP人工骨粒浸在纖維連接蛋白100g/l溶液中，4條件下放置1

8、6h。組：植入TP復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞。組：植入TP新穎自體骨髓(每側(cè)5l，共10l/只)。組：植入單純TP。組：植入自體髂骨皮質(zhì)松質(zhì)骨顆粒。植入材料均為5g。1.4.2手術(shù)方法兔耳靜脈苯巴比妥鈉35g/kg麻醉。剃毛、固定、消毒。胸椎后正中切口，顯露雙側(cè)椎板和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)；去除椎板小關(guān)節(jié)上軟組織，并將椎板、小關(guān)節(jié)皮質(zhì)骨打毛，刮勺刮去關(guān)節(jié)間隙局部軟骨。每側(cè)放置2.5g植骨材料。逐層縫合。術(shù)后分籠飼養(yǎng)。肌注青霉素80/d，共57d。1.5脊柱交融的評(píng)價(jià)方法1.5.1X線片結(jié)合T平掃及三維重建評(píng)估交融情況按照uryl3的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,3、4分時(shí)診斷為鞏固交融；2分、2分以下時(shí)診斷為假關(guān)節(jié)形成。由2名有經(jīng)

9、歷的醫(yī)生用雙盲法進(jìn)展評(píng)估。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.5.2非破壞性手工力學(xué)檢測取出整塊胸椎標(biāo)本，修剪標(biāo)本長度為交融節(jié)段加上下各1個(gè)椎體，保存上下各一節(jié)段正常未做交融節(jié)段的目的是做為交融節(jié)段力學(xué)檢測的比照。剔除周圍肌肉組織，去除前方椎體及保存各韌帶前方椎板，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、橫突，手工力學(xué)檢測，評(píng)價(jià)交融情況。1.5.3組織學(xué)分析將上述力學(xué)檢測的標(biāo)本用4福爾馬林固定24h，脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SAS6.12軟件非參數(shù)檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)P0.05時(shí)，為有顯著性差異。2結(jié)果2.1動(dòng)物一般情況術(shù)后2d內(nèi)死亡4只,及時(shí)補(bǔ)做實(shí)驗(yàn);其余動(dòng)物未見不良反響。2.2標(biāo)本大體觀察

10、剔除骨周軟組織，植骨材料周圍未見炎癥現(xiàn)象。組較、組交融骨塊體積大；在、組交融塊的外面可以看到不同程度的陶瓷顆粒嵌于交融塊中，組和組標(biāo)本的陶瓷顆粒與周圍組織粘附較嚴(yán)密，而組中陶瓷顆粒易于從周圍組織中剝離。2.3影像學(xué)觀察在X線片和T平掃及T三維重建上觀察交融骨塊，有以下特點(diǎn)：組的骨塊形成量相對(duì)較大、植骨與椎板交融界面及質(zhì)地均勻度均好于其它各組(圖14)。按照uryl3制定客觀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),4組之間鞏固交融的百分比有顯著性差異P=0.0324;組的交融率高于、組(P0.05(表1)。表2手工觸診力學(xué)檢測交融情況組別略2.4手工力學(xué)檢測按Bden4的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。組大局部獲得鞏固交融；組和組未交融標(biāo)本形成率

11、均接近50，而鞏固交融的比率相對(duì)低。組未交融比率明顯低于、組P0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；、3組之間無顯著性差異(表2)。表1放射學(xué)評(píng)分組別略2.5組織學(xué)觀察組：整個(gè)交融骨塊的陶瓷骨微孔內(nèi)全部充滿新生骨，中央有血管形成，無纖維結(jié)締組織圖5。組：交融骨塊的陶瓷骨微孔內(nèi)為新生骨和纖維結(jié)締組織，新生骨的量明顯少于組圖6。組：與、組相比，陶瓷骨顆粒微孔內(nèi)多為結(jié)締組織，新生骨的量少，只見少量新生骨貼附于陶瓷骨外表圖7。組：12周時(shí)，自體骨與椎板到達(dá)愈合，但骨小梁稀疏，沒有再血管化的傾向圖8。3討論自體移植骨可以為新骨形成提供必要的材料包括骨形成細(xì)胞、生長因子以及支撐骨細(xì)胞和細(xì)胞間基質(zhì)的支架構(gòu)造。但是自體骨移

12、植尚有某些缺乏之處，難以普遍推廣應(yīng)用。尋找自體骨替代材料的研究已有多年1,尚無一致的結(jié)論。一些研究認(rèn)為具有骨傳導(dǎo)作用的材料單獨(dú)應(yīng)用于脊柱后外側(cè)交融時(shí)不能獲得較高的交融率2。加上具有骨誘導(dǎo)作用的物質(zhì)特別是BP家族，比單用具有骨傳導(dǎo)作用的材料能獲得明顯高的交融率1。然而，BP費(fèi)用昂貴和可能引起異位骨化等副作用限制了其臨床應(yīng)用，況且BP在臨床試驗(yàn)性應(yīng)用中沒有獲得比單獨(dú)應(yīng)用自體移植骨5或脫鈣骨基質(zhì)更好的交融效果6。但也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)說明BSs+BP較新穎紅骨髓有更快、更強(qiáng)的成骨才能7。尋找更好的植骨交融材料是目前骨組織工程研究的熱點(diǎn)。BSs有多向分化潛能，在體外一定的誘導(dǎo)條件下可以擴(kuò)增分化為成骨細(xì)胞并分泌

13、細(xì)胞因子；TP陶瓷骨具有良好的生物相容性、孔隙率和機(jī)械性能，且能降解，是骨組織工程的良好載體。本實(shí)驗(yàn)研究說明用TP復(fù)合培養(yǎng)BSs進(jìn)展脊柱交融比單獨(dú)應(yīng)用TP獲得明顯高的鞏固交融率，并且有比自體骨交融率更高的趨勢。TP可能影響放射學(xué)評(píng)分，在X線片和T均表現(xiàn)出有連續(xù)性骨塊，但組織工程化骨組比單純應(yīng)用TP組似乎更均勻同質(zhì)并且植骨與椎板連接更嚴(yán)密。這個(gè)結(jié)果在大體標(biāo)本上也能證實(shí)：單獨(dú)應(yīng)用TP進(jìn)展交融動(dòng)物的交融塊中，其陶瓷顆粒容易從交融塊周圍組織中剝脫，而應(yīng)用TP復(fù)合BSs或參加新穎骨髓進(jìn)展交融的交融塊中，其陶瓷顆粒不容易從周圍組織中剝脫。已經(jīng)有很多研究通過長骨缺損的動(dòng)物模型證實(shí)了新穎骨髓的骨誘導(dǎo)作用,然而

14、當(dāng)新穎骨髓被用于脊柱后外側(cè)交融時(shí)，其結(jié)果爭議很大1，3。本研究說明，用TP復(fù)合BSs進(jìn)展交融，其交融率比應(yīng)用簡單機(jī)械混合新穎骨髓的TP交融率高，并且組織學(xué)分析I組中新生骨的量明顯比組多。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)BSs經(jīng)過體外刺激分化為骨祖細(xì)胞后可以種植到TP陶瓷骨上，這種復(fù)合材料在脊柱交融實(shí)驗(yàn)研究中可以促進(jìn)新骨形成，其交融效果明顯好于單純TP陶瓷骨材料。參考文獻(xiàn)：1BdenSD，artinGJJr，rne，etal.Theusefrallinehydrxyapatiteithbnearr,autgenusbnegraft,rsteindutivebneprtEinextratfrpsterlateral

15、lubarspinefusinJ.Spine,1999,15;24(4):320-327.2IthH，EbaraS，Kaiura，etal.ExperientalspinalfusinithusefrebinanthuanbnerphgenetiprtEIn2J.Spine,1999，15;24(14):1402-1405.3urylLJ,JhnstneB,PetersilgeA,etal.AugentatinfspinalarthrdesisithautlgusbnearrinarabbitpsterlateralspinefusindelJ.Spine，1999，5:434-438.4BdenSD，ShiandleJH,Huttn.Anexperientallubarintertransversepressspinalfusindel.Radigraphi,histlgi,andbiehanialhealingharateristisJ.Spine,1995,15;20(4):412-420.5FriedlanderGE,laytnRP,leDJ,etal.stegeniPrtein1(BP7)inthetreaten