IgA腎病小鼠模型的建立與鑒定

1、IgA腎病小鼠模型的建立與鑒定【摘要】目的建立小鼠IgA腎病模型，為臨床研究IgA腎病提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法昆明種小鼠30只，分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(20只)。采用口服牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B(SEB)的方法制作小鼠IgA腎病模型。第12周末搜集新穎尿液，顯微鏡下尿紅細(xì)胞定性檢驗(yàn);摘眼球取血，檢測(cè)血肌酐(Sr)、尿素氮(BUN);光鏡法觀察腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)變化;電鏡法檢測(cè)系膜區(qū)有無(wú)電子致密物沉積;免疫熒光法觀察系膜區(qū)IgA沉積情況。結(jié)果第12周末，模型組小鼠均出現(xiàn)不同程度的血尿;Sr、BUN較正常對(duì)照組顯著增高(P0.01);光鏡下系膜細(xì)胞及基質(zhì)明顯增生;

2、電鏡下系膜區(qū)電子致密物沉積;免疫熒光示系膜區(qū)大量的IgA沉積，而正常對(duì)照組那么無(wú)上述表現(xiàn)。結(jié)論IgA腎病小鼠模型效果良好，病理、電鏡及臨床指標(biāo)與人類IgA腎病臨床病理相似。【關(guān)鍵詞】IgA腎病;模型;血尿;免疫熒光;小鼠Abstrat:bjetiveTestablishusedelfIgAnephrpathyinrdertprvideexperientbasisfrthelinialresearhfIgAnephrpathy.ethds30Kuningieererandlyassignedintthentrlgrup(n=10)andthedelgrup(n=20).usedelfIgAnep

3、hrpathyasestablishedbytheethdfralintakefbvineserualbuin(BSA)tgetherithinjetinfstaphylusentertxinB(SEB)viatheaudalvEin.Attheendfthe12eeks,freshurineasgatheredfrthequantitativetestfheaturia;bldastakenthrughrbitalsinusaftereyeballextirpatintdeterinetheserureatinine(Sr)andbldureanitrgen(BUN);thehangesfe

4、sangialellsandatrixinthekidneyserebservedbylightirspy;eletrnirspyaseplyedtdeteteletrn-densedepsitsintheesangialarea;theexpressinfIgAdepsitinaseasuredbyiunfluresenestainingintheesangialarea.ResultsBytheendf12eeks,thereeredifferentdegreesfheaturiaindelgrupie.BUNandSrlevelsindelgruperesignifiantlyhighe

5、rthaninthenralntrlgrup(P0.01).Lightirspyshedevidentprliferatinfesangialellsandatrix.Eletrnirspydenstratedahigheletrndensedepsitinintheesangialarea,hiletheabveabnralitieserentbservedinthenralntrlgrup.nlusinTheusedelfIgAnephrpathyprveseffetive,ithpathlgialeletrnirspiandlinialparaeterssiilartthelinialp

6、athlgyfhuanIgAnephrpathy.Keyrds:IgAnephrpathy;del;heaturia;iunfluresenestaining;ieIgA腎病世界范圍內(nèi)廣發(fā)的一種系膜增生型腎小球腎炎，占原發(fā)性腎小球疾病的10%20%，中國(guó)、日本、新加坡等發(fā)病率較高，其中有20%30%的患者進(jìn)展到腎衰1。建立與人類臨床病理生理相似的IgA腎病動(dòng)物模型，對(duì)研究IgA腎病的發(fā)病機(jī)理、臨床治療等具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用口服牛血清白蛋白結(jié)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素的方法制作IgA腎病小鼠模型，為進(jìn)一步探究IgA腎病提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備牛血

7、清白蛋白(BSA,上海明睿生物，產(chǎn)品批號(hào)RF101-010);葡萄球菌腸毒素B(SEB,北京博邁世紀(jì)生物技術(shù));兔抗小鼠IgA抗體(北京博奧森生物技術(shù)，抗體貨號(hào)bs-0774R);異硫氰酸熒光素(FIT)-標(biāo)記的羊抗兔IgG(illiprerpratin);irH340石蠟切片機(jī);光學(xué)顯微鏡(日本artn);日本SysexA-1500自動(dòng)生化分析儀;電鏡(H-600)，切片機(jī)(LKBV型)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1酸化水的制備新穎的雙蒸水中參加鹽酸，濃度為8.5l/L。即1000l雙蒸水中參加10%鹽酸3.2l。1%BSA酸化水的制備,1gBSA參加100l酸化水。1.2.2造模方法適應(yīng)性喂養(yǎng)

8、1周后，取新穎尿液進(jìn)展顯微鏡下尿紅細(xì)胞檢測(cè)，均為陰性，將30只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(20只)。正常對(duì)照組小鼠自由飲水與飲食;模型組小鼠除自由飲水和飲食外，前5周隔日予BSA(200g/kg)灌胃;第6周起予BSA(20g/kg，500gBSA溶于500l無(wú)菌生理鹽水中)尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3天;第8周起予SEB(0.5g/kg,1gSEB溶于25l無(wú)菌生理鹽水中)尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)3周，觀察至第12周末。1.2.3IgA腎病小鼠模型的鑒定1.2.3.1血、尿液檢測(cè)第12周末留取小鼠新穎尿液，行尿紅細(xì)胞定性檢測(cè);經(jīng)摘眼球取血(待測(cè)Sr，BUN)后，處死小鼠，留取

9、右側(cè)腎臟分別固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理(光鏡和電鏡)及免疫熒光檢查。1.2.3.3電鏡檢查取材,前固定,漂洗,后固定,漂洗,脫水，置換及浸透，包埋及聚合，修塊及切片，染色，電鏡觀察。1.2.3.4免疫熒光小鼠腎組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5切片依次經(jīng)二甲苯20in,二甲苯20in,95%乙醇5in,95%乙醇5in,雙蒸水5in3次,3%H2210in,PBS5in3次,抗原修復(fù)(微波爐中高火5in,低火15in),自然冷卻,PBS5in3次,5%羊血清1h,兔抗小鼠IgA(1100),4過夜,PBS5in3,FIT標(biāo)記羊抗兔IgG(1100)4過夜,PBS5in3,甘油封片,熒光

10、顯微鏡下觀察攝像。免疫熒光半定量標(biāo)準(zhǔn):半定量標(biāo)準(zhǔn)參照目前國(guó)內(nèi)通用的5級(jí)法(+)分級(jí):：低倍鏡下不能顯示;+：低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見;+:低倍鏡下可見，高倍鏡下明晰可見;+：低倍鏡下明晰可見，高倍鏡下耀眼;+:高倍鏡下刺眼。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展處理，計(jì)數(shù)資料用s差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);等級(jí)資料用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。P0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1一般情況造模過程中，正常對(duì)照組小鼠無(wú)死亡，模型組小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器誤插入氣管，或插入過深導(dǎo)致小鼠食管及胃黏膜損傷。尾靜脈注射SEB后，小鼠出現(xiàn)倦耽

11、少吃少動(dòng)等現(xiàn)象，2h后恢復(fù)正常。2.2血、尿指標(biāo)檢測(cè)12周末，采集新穎尿液光鏡下尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示模型組小鼠明顯高于正常對(duì)照組(P0.01)(表1);摘眼球取血，留取血清，檢測(cè)血Sr和BUN。結(jié)果顯示模型組較正常對(duì)照組明顯升高(P0.01)(表2)。表12組小鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的比擬表22組血BUN和Sr的比與正常對(duì)照組比擬：*P0.012.3鏡下構(gòu)造改變2.3.1光鏡模型組小鼠腎組織主要表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，系膜細(xì)胞及基質(zhì)明顯增生，毛細(xì)血管腔局部閉鎖，局部小管擴(kuò)張;光鏡下正常對(duì)照組小鼠腎小球，腎小管，及間質(zhì)組織形態(tài)構(gòu)造未見異常，系膜細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)未見增多(圖1)。圖112周末，各組小鼠

12、光鏡下腎組織病理變化的比擬(H-E染色，400)A.模型組,腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,毛細(xì)血管腔局部閉鎖，局部小管擴(kuò)張;B.正常對(duì)照組,腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)未見增生,毛細(xì)血管開放良好2.3.2電鏡模型組小鼠腎小球系膜區(qū)有大量電子致密物沉積，而正常組小鼠腎小球系膜區(qū)無(wú)或有少量的電子致密物沉積(圖2)。圖212周末，各組小鼠電鏡下腎組織病理變化的比擬(10000)A.模型組,系膜區(qū)大量的電子致密物沉積;B.正常對(duì)照組,系膜區(qū)無(wú)電子致密物沉積2.4免疫熒光檢測(cè)12周末，免疫熒光可以看到，系膜區(qū)IgA熒光強(qiáng)度大多為+，而正常組系膜區(qū)IgA熒光強(qiáng)度為+，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3、圖3)。表32組小鼠腎臟系

13、膜區(qū)IgA熒光半定量比擬3討論自Rifai等于1979年首次用BALB/小鼠成功制作IgA腎病模型以來(lái)，許多學(xué)者基于IgA腎病的發(fā)病機(jī)制成功復(fù)制了許多IgA腎病模型2-6。主要包括:免疫誘導(dǎo)型、繼發(fā)病變型、自發(fā)病變型。但由于存在種種問題，與人的IgA腎病病理變化差距很大，模型建立的滯后導(dǎo)致對(duì)IgA腎病的研究較少，對(duì)IgA腎病的治療未獲得新的手段。國(guó)內(nèi)常用的IgA腎病為異種蛋白所誘導(dǎo)的免疫誘導(dǎo)型，即口服牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素(SEB)。由于局部患者對(duì)某些上呼吸道病原體、腸道菌群、食物抗原有較高的血清抗體滴度，認(rèn)為黏膜免疫在發(fā)病中起到一定作用7。故口服免疫原如BSA及靜

14、脈注射葡萄球菌、大腸桿菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫復(fù)合物常用于誘導(dǎo)主動(dòng)性IgA腎病模型。BSA口服免疫可使機(jī)體IgA抗體的產(chǎn)生，SEB的詳細(xì)機(jī)制目前還不十清楚確，大多數(shù)認(rèn)為SEB還可破環(huán)肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，引起IgA去除不完全，進(jìn)而引起免疫復(fù)合物在系膜區(qū)的沉積。17只模型小鼠熒光證實(shí)全部有IgA沉積;光鏡下腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生;電鏡下腎小球系膜區(qū)可見大量的高電子密度的致密物沉積;臨床的尿、血檢測(cè)隨著腎臟病理變化的加重而逐漸加重，且與正常組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模成功。此方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，成功率高，應(yīng)該是目前理想的、有研究?jī)r(jià)值的動(dòng)物模型，能為進(jìn)一步研究IgA腎病的發(fā)病機(jī)

15、制及治療提供根底平臺(tái)。【參考文獻(xiàn)】1DnadiJV，GrandeJP.IgAnephrpathyJ.NEnglJed，2002，347(10)：738-748.2BagheriN,PeppleDA，Hassan,etal.DevelpentfiuneplexglerularinjuryJ.LabInvest,2022,85(3):354-363.3JiaQ,PestkaJJ.Rlefylxygenase-2indexynivalenl-induediunglbulinanephrpathyJ.FdheTxil,2022,43(5):721-728.4KyaaA,SharinS,SakuraiH,etal.StaphylusaureusellenvelpeantigenisaneandidatefrtheindutinfIgAnephrpathyJ.KidneyInt,2022,66(1):121-132.5SuzukiS,GejyF,NakatiY,etal.RlefIgA,IgG,andIgantibdiesagainstHaephilusparainfluenzaeantigensinIgAnephrpathyJ.linNephrl,1996,46(5)：287-295.6SharinS,S