課程總結(jié)生物大分子分離純化的總體策略

1、資料未來最好的方法就是把它創(chuàng)造出來。法國(guó)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)段訓(xùn)練總結(jié)生命大分子物質(zhì)的性質(zhì)及概述研究的基本生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、酶（也是一種蛋白質(zhì)）和核酸，這三類物質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的問題，沒有能夠達(dá)到足夠純度的生物大分子的工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無(wú)從談起。與化學(xué)產(chǎn)品的分離相比較，生物大分子的有以下主要特點(diǎn)：生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。其中許多化合物至今還是個(gè)謎，有待人們研究與開發(fā)。有的生

2、物大分子在分離過程中還在不斷的代謝，所以生物大分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離的標(biāo)準(zhǔn)方法是不可能的。許多生物大分子在生物材料中的含量極微，只有萬(wàn)分之一、幾十萬(wàn)分之一，甚至幾百萬(wàn)分之一。分離純化的步驟繁多，流程又長(zhǎng)，有的目的產(chǎn)物要經(jīng)過十幾步、幾十步的操作才能達(dá)到所需純度的要求。例如由腦垂體組織取得某些激素的因子，要用幾噸甚至幾十噸的生物材料，才能提取出幾毫克的樣品。許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取最之處。過酸、過堿、高溫、劇烈的攪拌、強(qiáng)輻射及本身的自溶等都會(huì)使生物大分子變性而失活，所以分離純化時(shí)一定要

3、選用最適宜的環(huán)境和條件。生物大分子的幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，必須權(quán)衡利弊，綜合考慮。因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果常有很大的經(jīng)驗(yàn)成份，個(gè)人的實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有較大的影響。正是由于生物大分子的分離和是如此的復(fù)雜，因而實(shí)驗(yàn)方法和流程的設(shè)計(jì)就必須盡可能多查文獻(xiàn)，多參照前人所作的工作，吸取其經(jīng)驗(yàn)和精華，探索中和反復(fù)是不可避免的，但是其樂趣與智慧也正體現(xiàn)于此。生物大分子的通?？砂匆韵虏襟E進(jìn)行：確定要的生物大分子的目的和要求，是進(jìn)行科研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵，因?yàn)樗钦麄€(gè)分離純化過程的“眼睛”。通

4、過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。生物材料的破碎和預(yù)處理。分離純化方案的設(shè)計(jì)和探索，這是最關(guān)鍵也是最體現(xiàn)研究者智慧的環(huán)節(jié)。生物大分子物的均一性（即純度）的鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或 HPLC 和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。當(dāng)純化的對(duì)象選定之后，首先碰到是，此物質(zhì)在哪些材料中含有？哪些材料中含量較豐富？其次是在從選定的材料提純此物質(zhì)的過程中，純度是否逐漸增加？也就是說，所用的純化方案是否合適？要回答這些問題就必須確立專一、準(zhǔn)確、靈敏和簡(jiǎn)便的測(cè)定方法。由于有效成分在原材料中含量較低。這一事實(shí)決定了抽提液和純化的前一階段溶液中有效成

5、分的比活性較小，加之此時(shí)測(cè)定的樣品很多（每一步驟都需測(cè)定），因而確立的測(cè)定方法應(yīng)簡(jiǎn)單、靈敏、花時(shí)間少。此外，確立的方法要專一性強(qiáng)、可比性強(qiáng)。否則，所測(cè)得的結(jié)果誤差大。鑒于實(shí)驗(yàn)材料的豐富多彩，對(duì)于同一種物質(zhì)往往有不同的測(cè)定方法，故而在選擇時(shí)總的原則是根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的生理生化特點(diǎn)選擇干擾中運(yùn)用同一方法，以取得可比性。最小的方法，并在同系列操作分析測(cè)定的方法主要有兩類：即生物學(xué)和物理、化學(xué)的測(cè)定方法。生物學(xué)的測(cè)定法主要有酶的各種測(cè)活方法、蛋白質(zhì)含量的各種測(cè)定法、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等；物理、化學(xué)方法主要有比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及

6、核磁等。實(shí)際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測(cè)定更加快速、簡(jiǎn)便。生物大分子物的均一性（即純度）的鑒定，通常只采用法是不夠充分的，必須同時(shí)采用 23 種不同的純度鑒定法共同映證確定。蛋白質(zhì)和酶制成品純度的鑒定最常用的方法是：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，如能再用高效液相色譜（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）進(jìn)行聯(lián)合鑒定則更為理想。核酸的純度鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，但最方便的還是紫外吸收法，即測(cè)定樣品在 7.0 時(shí) 260nm 與280nm 的吸光度（A260 和 A280），從 A260/A280 的比值即可判斷核酸樣品的純度。要了解的生物大分子的物理、化學(xué)

7、性質(zhì)主要有：在水和各種中的溶解性。在不同溫度、值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)等。其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。對(duì)其他生物分子的特殊親和力等。生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。各種方法的基本原理基本上可以歸納為兩個(gè)方面：一是利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如

8、鹽析、沉淀、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場(chǎng)的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達(dá)到分離的目的，如電泳、離心、超濾等，目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的是電泳、層析和高速與超速離心。由于生物大分子不能加熱熔化和汽化，因而所能分配的物相只限于固相和液相，在此兩相之間交替進(jìn)行分離純化。在實(shí)際工作中往往要綜合運(yùn)用多種方法，才能出高純度的生物大分子。純化生物大分子總是希望純度和產(chǎn)率都要高。例如純化某種酶，理想的結(jié)果是比和總回收率都要高才好，但實(shí)際上兩者不能兼得，通常在科研上希望比盡可能的高，而犧牲一些回收率，在工業(yè)生產(chǎn)上相反。一、 生物大分子1 生物材料的選擇的前處理

9、生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?。材料的來源無(wú)非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。從工業(yè)生產(chǎn)角度選擇材料，應(yīng)選擇含量高、來源豐富、工藝簡(jiǎn)單、成本低的原料，但往往這幾方面的要求不能同時(shí)具備，含量豐富但來源，或含量來源較理想，但材料的分離純化方法繁瑣，流程很長(zhǎng)，反倒不如含量低些但易于獲得純品的材料，由此可見，必須根據(jù)具體情況，抓住主要決定取舍。從科研工作的角度選材，則只須考慮材料的選擇符合實(shí)驗(yàn)預(yù)定的目標(biāo)要求即可。除此之外，選材還應(yīng)注意植物的季節(jié)性、地理位置和生長(zhǎng)環(huán)境等。選動(dòng)物材料時(shí)要注意其、營(yíng)養(yǎng)狀況、遺傳素質(zhì)和生理狀態(tài)等。動(dòng)物在饑餓時(shí)，脂類和糖類含量相對(duì)減少，有利于生物大分子的提取分離。選微生

10、物材料時(shí)要注意菌種的代數(shù)和培養(yǎng)基成分等之間的差異，例如在微生物的對(duì)數(shù)期，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產(chǎn)量。材料選定后要盡可能保持新鮮，盡快加工處理，動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，如果所要求的成分在?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開。生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存。動(dòng)物材料則需深度冷凍保存。2 細(xì)胞的破碎除了某些細(xì)胞外的多肽激素和某些蛋白質(zhì)與酶以外，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)或多細(xì)胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細(xì)胞和組織破碎，使生物大分子充分到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位

11、的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的素、半素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。(1)機(jī)械法：1) 研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動(dòng)物細(xì)胞破碎，這種方法比較溫和，適宜使用。工業(yè)生產(chǎn)中可用電動(dòng)研磨。細(xì)菌和植物組織細(xì)胞的破碎也可用此法。2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通常可先用家用機(jī)將組織打碎，然后再用 10000r/min20000r/min 的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn) 10 秒20 秒，停 10

12、 秒20 秒，可反復(fù)多次。(2)物理法：1) 反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至15到20，然后放于室溫(或 40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶碎。2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。使用時(shí)注意降溫，防止過熱。1000105Pa2000105Pa 的3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔突然至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細(xì)胞的方法，但儀器費(fèi)用較高。4) 冷熱交替法：從細(xì)菌或中提取

13、蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在 90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物出來，此法稱為自溶法。使用時(shí)要特別操作，因?yàn)樗饷覆粌H可以使細(xì)胞壁和膜破壞，同時(shí)也可能會(huì)把某些要提取的有效成分分解了。2) 溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜出細(xì)胞內(nèi)含物。3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、處理 15 分鐘，可以專一性地將細(xì)胞

14、壁分解，素酶、蝸牛酶和酯酶等，于 37， 8，出細(xì)胞內(nèi)含物，此法適用于多種微生物。4)處理法：利用氯仿、甲苯、等脂溶性溶劑或 SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。3 生物大分子的抽提“抽提”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。這一過程是將目的產(chǎn)物與細(xì)胞中其他化合物和生物大分子分離，即由固相轉(zhuǎn)入液相，或從細(xì)胞內(nèi)的生理狀況轉(zhuǎn)入外界特定的溶液中。影響提取的主要有：目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??；由固相擴(kuò)散到液相的難易；溶劑的值和

15、提取時(shí)間等。一種物質(zhì)在某一溶劑中溶解度的大小與該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般地說，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的值，溶解度增加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。 水溶液提?。旱鞍踪|(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個(gè)主要影響是：1) 鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質(zhì)，如 DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強(qiáng)度

16、下溶解度增加，而另一些物質(zhì)，如 RNA-蛋白復(fù)合物，在低離子強(qiáng)度下溶解度增加，在高離子強(qiáng)度下溶解度減小。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。但中性鹽的濃度增加至一定時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為“鹽析”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。所以低鹽溶液常用于大多數(shù)生化物質(zhì)的提取。通常使用 0.02 mol/L 0.05 mol/L 緩沖液或 0.09 mol/L 0.15 mol/L NaCl 溶液提

17、取蛋白質(zhì)和酶。不同的蛋白質(zhì)極性大小不同，為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl 或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。2)值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在=68 范圍內(nèi)，提取溶劑的應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。堿性蛋白質(zhì)選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選在偏堿的一側(cè)，以增加蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶為堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，則常用稀堿來提取。3) 溫度：為防止變性和降解，

18、具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在 05的低溫操作。但少數(shù)對(duì)溫度耐受力強(qiáng)的蛋白質(zhì)和酶，可提高溫度使雜蛋白變性，有利于提取和下一步的純化。4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：在提取蛋白質(zhì)、酶和核酸時(shí)，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)。為防止這一現(xiàn)象的發(fā)生，常常采用加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的、離子強(qiáng)度或極性等方法使這些水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用。例如在提取DNA 時(shí)加入 EDTA 絡(luò)合DNAase 活化所必須的 Mg+。5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性

19、失活。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的提取。常用的有乙醇、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性，其中正丁醇在 0時(shí)在水中的溶解度為 10.5，40時(shí)為 6.6，同時(shí)又用具有較強(qiáng)的親脂性，因此常用來提取與脂結(jié)合較牢或極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類。例如植物中的蛋白、麩蛋

20、白，常用 7080的乙醇提取，動(dòng)物組織中一些線粒體及微粒上的酶常用丁醇提取。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。例如，胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的糜蛋白酶對(duì)胰島素有極高的水解活性，因而采用 6.8乙醇溶液并用草酸調(diào)溶液的為 2.53.0，進(jìn)行提取，這樣就從下面三個(gè)方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：6.8的乙醇可以使糜蛋白酶暫時(shí)失活；草酸可以除去激活糜蛋白酶的 Ca+2.53.0，是糜蛋白酶不宜；選用作用的值。以上條件對(duì)胰島素的溶解和穩(wěn)定性都沒有影響，

21、卻可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。二、 生物大分子的分離純化由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬(wàn)種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個(gè)適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分的基本是相同的。為了避免盲目性，節(jié)省實(shí)驗(yàn)探索時(shí)間，要認(rèn)真參考和借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，少走彎路。常用的分離純化方法和技術(shù)有：沉淀法（包括：鹽析、沉淀、選擇性沉淀等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速焦電泳等。1 分離純化方案的設(shè)計(jì)與選擇型液相色譜以及等電聚純化方案是指在純化過程中幾種純化方法有機(jī)地聯(lián)合應(yīng)用的總稱。它是成功地達(dá)到純化目的的前提。純化方案合理，就能事半功

22、倍。鑒于純化方案是由幾種純化方法組成的，因此，設(shè)計(jì)純化方案時(shí)，首先要選擇純化方法。一般選擇純化方法的依據(jù)，總的原則是從抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異性考慮的。生物大分子能否高效率地成功，關(guān)鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個(gè)分離純化方法實(shí)驗(yàn)條件的探索。選擇與探索的依據(jù)就是生物大分子與雜質(zhì)之間的生物學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)上的差異。由本章前述的生物大分子的各種特點(diǎn)可以看出，分離純化方案必然是千變?nèi)f化的。生物大分子的方法可以粗略地分類如下： 以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。 以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。 以電

23、荷差異為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 以生物學(xué)功能專一性差異為依據(jù)的方法：親和層析等。表 1各種主要分離純化方法的比較：方 法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng) 用 范 圍沉淀法蛋白質(zhì)的沉淀作用操作簡(jiǎn)便、成本低廉、對(duì)蛋白質(zhì)和酶有保護(hù)作用，重復(fù)性好分辨力差，純化倍數(shù)低，蛋白質(zhì)沉淀中混雜大量鹽分蛋白質(zhì)和酶的分級(jí)沉淀沉淀脫水作用和降低介電常數(shù)操作簡(jiǎn)便，分辨力較強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)或酶有變性作用，成本較高各種生物大分子的分級(jí)沉淀選擇性沉淀等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等沉淀作用選擇性較強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便，種類較多應(yīng)用范圍較窄各種生物大分子的沉淀結(jié)晶法溶解度達(dá)到飽和，溶質(zhì)形成規(guī)則晶體純化效果較好，可除去微量雜

24、質(zhì)，方法簡(jiǎn)單樣品的純度、濃度都要很高，時(shí)間長(zhǎng)蛋白質(zhì)或酶等吸附層析化學(xué)、物理吸附操作簡(jiǎn)便易受離子干擾各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源離子交換層析離子基團(tuán)的交換分辨力高，處理量較大需酸堿處理樹脂平衡洗脫時(shí)間長(zhǎng)能帶電荷的生物大分子凝膠過濾層析分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高，不會(huì)引起變性各種凝膠介質(zhì)昂貴，處理量有限制分子量有明顯差別的可溶性生物大分子分配層析溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)的差異分辨力高，重復(fù)性較好，能分離微量物質(zhì)影響因子多，上樣量太小用于各種生物大分子的分析鑒定親和層析生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大各種生物大分子聚焦層析等電點(diǎn)和離子交換

25、作用分辨力高進(jìn)口試制昂貴蛋白質(zhì)和酶在分離純化流程中，早期（初始步驟：粗分級(jí)過程）和后期（精分級(jí)）的分離純化方法的選擇策略也有明顯的不同： 初始的粗分級(jí)分離純化1) 特點(diǎn)：粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。欲的生物大分子濃度很稀。物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)差異大的雜質(zhì)。2) 對(duì)所選方法的要求：要快速、粗放。能較大地縮小體積。分辨力不必太高。負(fù)荷能力要大。3) 可選用的方法：吸附；萃??；沉淀法（熱變性、鹽析、換（批量吸附、胖柱交換）；親和層析等。沉淀等）；離子交 后期的精分級(jí)分離純化可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦電泳、HP

26、LC 等。要注意的一些問題：鹽析后要及時(shí)脫鹽。用凝膠過濾時(shí)如何縮小上樣體積，因?yàn)槟z層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/101/6，也可以使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。必要時(shí)也可以重復(fù)使用同一種分離純化方法，例如分級(jí)沉淀，分級(jí)鹽析，連續(xù)兩次凝膠過濾或離子交換層析等。分離純化步驟前后要有科學(xué)的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過濾之前，因?yàn)殡x子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過柱交換容量即可。分離純化后期，目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高，此時(shí)對(duì)于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下（如在

27、冷室中）進(jìn)行。固相酶法待分離物與固相載體之間有特異親和力分辨力高，用于連續(xù)生產(chǎn)有局限性抗體、抗原、酶和底 物等電聚焦連續(xù)電泳等電點(diǎn)的差異分辨力很高 ，可連續(xù)儀器試劑昂貴蛋白質(zhì)和酶高速與超速離心沉降系數(shù)或密度的差異操作方便，容量大離心機(jī)設(shè)備昂貴各種生物大分子超濾分子量大小的差異操作方便，可連續(xù)生產(chǎn)分辨力低，只能部分純化各種生物大分子HPLC凝膠過濾、離子交換、反向色譜等分辨力很高，直接出純品柱和 HPLC 儀器昂貴各種生物大分子得到最終產(chǎn)品后，必要時(shí)要立即分裝并寫明，仔細(xì)保存。2純化方案的評(píng)價(jià)對(duì)純化方案的評(píng)價(jià)，實(shí)質(zhì)上是對(duì)組成純化方案的每一個(gè)純化方法的評(píng)價(jià)。它們的應(yīng)用價(jià)值要通過實(shí)踐檢驗(yàn)。其方法是，

28、對(duì)純化過程的每一步收集的溶液都進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定，并將比（數(shù)/毫克蛋白）、純化倍數(shù)（每步的比/粗抽提液的比）和收得率（時(shí)間：生化和分子生物學(xué)樣品不可能存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。現(xiàn)以保存蛋白質(zhì)和酶為例：低溫下保存：由于多數(shù)蛋白質(zhì)和酶對(duì)熱敏感，通常 3540以上就會(huì)失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白質(zhì)和酶越純?cè)讲环€(wěn)定，溶液狀態(tài)比固態(tài)更不穩(wěn)定。因此通常要保存于520，如能在70下保存則最為理想。極少數(shù)酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時(shí)煮沸；胰蛋白酶在稀HCl 中可以耐受 90；蔗糖酶在 5060可以保持 15 min30 min 不

29、失活。還有少數(shù)酶對(duì)低溫敏感，如鳥肝酸羧化酶 25穩(wěn)定，低溫下失活，過氧化氫酶要在 04保存，冰凍則失活，羧肽酶反復(fù)凍融會(huì)失活等。制成干粉或結(jié)晶保存：蛋白質(zhì)和酶固態(tài)比在溶液中要穩(wěn)定的多。固態(tài)干粉制劑放在干燥劑中可長(zhǎng)期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉 0下可保存 2 年，15下可保存 8 年。通常，酶與蛋白質(zhì)含水量大于 10，室溫低溫下均易失活，含水量小于 5時(shí)，37活性會(huì)下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于 10，抑制化學(xué)活性，含水量要小于 3。此外要特別注意酶在凍干時(shí)往往會(huì)部分失活。在保護(hù)劑下保存：很早就有人觀察到，在無(wú)菌條件下，室溫保存了 45 年的血液，血紅蛋白僅有少量改變，許多酶仍保留部分活

30、性，這是因?yàn)檠褐杏械鞍踪|(zhì)穩(wěn)定的，為了長(zhǎng)期保存蛋白質(zhì)和酶，常常要加入某些穩(wěn)定劑：例如：惰性的生化或有機(jī)物質(zhì)：如糖類、脂肪酸、牛白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩(wěn)定的疏水環(huán)境。中性鹽：有一些蛋白質(zhì)要求在高離子強(qiáng)度（1 mol/L4mol/L 或飽和的鹽溶液）的極性環(huán)境中才能保持活性。最常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4 等。使用時(shí)要脫鹽。巰基試劑：一些蛋白質(zhì)和酶的表面或含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保存時(shí)可加入半胱氨酸或巰基乙醇。總之，對(duì)樣品的保存必須給以足夠的重視，各種生物大分子和生物制劑的保存條件，可查閱有關(guān)的文獻(xiàn)和酶學(xué)手冊(cè)。參考文獻(xiàn)：生物化學(xué)

31、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用，編著，賢主編碗第三版，第一版大學(xué)科學(xué)化學(xué)工業(yè)生物化學(xué)技術(shù)生物化學(xué)儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)讀物：生命科學(xué)史王水平 譯白花文藝生物分子科學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)紅孟祥春 譯湖南科學(xué)技術(shù)【美文賞析】生 命 的 意 義里弗不管怎么看，生命總是很奇特。例如，都是由極其相同的物質(zhì)組成，而且的原子物質(zhì)與這個(gè)星球上最雄偉的山峰和系中最明亮的星辰的物質(zhì)完全相同也許，這就是生命如此莫名其妙的原因。首先想，為什么會(huì)對(duì)巨大的物體和成就刮目相看，情有獨(dú)鐘？而實(shí)際上，正是一個(gè)個(gè)細(xì)小的事物聚沙成塔，才成就了樁樁大事。為什么想方設(shè)法營(yíng)造自己的小世界，結(jié)果卻產(chǎn)生錯(cuò)覺，認(rèn)為自己完全掌控了整個(gè)生命的存在？而千真萬(wàn)確地

32、知道，事實(shí)并非如此。為什么一味追求個(gè)性，認(rèn)為這是生命的本質(zhì)，繼而又大言不慚地承認(rèn)，幾乎在生命的每一個(gè)方面，都存在共性？為什么孩子相信神話，而大人不相信呢？為什么對(duì)毫不讓步，而事實(shí)上，正是彼此間的差異才使得生命如此有趣？畢竟，總有一半世界是大頭朝下的，所以完全沒有理由要求相同。事事意見怒火小，更有時(shí)，為什么選擇爭(zhēng)吵和打斗？而實(shí)際上，跳一曲恰恰舞更，如此不是更能化解緊張的局面嗎？作為同一物種，是如此的相互接近，而為什么又總是披上自己的外衣，掩飾內(nèi)心深處的情感與信念，使無(wú)法真正的相互親近？也許，生活并非總像表面上看起來的那樣，所以才會(huì)出現(xiàn)困惑。作為一個(gè)物種，迷戀膚淺的外表。都戴著有色眼鏡，所以大多數(shù)人看不到自己想看到的東西。最終睜開眼睛時(shí)，可能會(huì)大為，沒有想到因?yàn)樽约旱莫M隘，竟會(huì)這樣模糊地看世界。摘掉有色眼鏡，可以更真切的發(fā)現(xiàn)自我，詢問有關(guān)