臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：第18章 自動(dòng)化儀器分析

1、第十八章 免疫自動(dòng)化儀器分析及應(yīng)用 免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化 （automation of immunoassays) 是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理、打印報(bào)告和檢測(cè)后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化進(jìn)行。自動(dòng)化分析技術(shù)自動(dòng)化免疫比濁分析技術(shù)熒光免疫自動(dòng)分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析酶聯(lián)免疫分析技術(shù)第一節(jié) 自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng)一、免疫透射比濁法1959年Schultze1967年Ritchie1977年sternberg 1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）儀器工作過(guò)程 2.將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過(guò)量的抗血清

2、混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測(cè)定各管吸光度。 3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算出抗原濃度。（三）方法評(píng)價(jià) 優(yōu)點(diǎn): 靈敏度較單擴(kuò)高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確 不足: 抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 透射比濁測(cè)定在抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢 測(cè)需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)。 用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2 m），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單

3、個(gè)膠乳顆粒不阻礙光線透過(guò)，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強(qiáng)。 二、免疫膠乳比濁法（一）原理：（二）方法評(píng)價(jià) 本法敏感度大大高于普通比濁法，可達(dá)ng/L水平，操作簡(jiǎn)便，易自動(dòng)化； 血清中的RF可與IgG Fc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象； 免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。三、免疫散射比濁法(一) 原理II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24 I ：與入射光成角處散射光強(qiáng)度；：入射光的波長(zhǎng)； I0：入射光的強(qiáng)度；dn/dc：校正因子，反映了溶液折射

4、指數(shù)和顆粒濃度的變化；M：顆粒分子量； c：濃度；N：阿佛加德指數(shù)；：顆粒到檢測(cè)器的距離；：散射光與入射光的夾角（散射夾角）。45Debye散射定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過(guò)量的情況下，加入待測(cè)抗原，此時(shí)反應(yīng)立即開(kāi)始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開(kāi)抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號(hào)在開(kāi)始反應(yīng)7.5s2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專(zhuān)門(mén)在抗原抗體反應(yīng)的最佳時(shí)段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測(cè)誤差降到最低。 (二)定時(shí)散射比濁法（fixed time nephelometry）定時(shí)散射比濁法測(cè)定原理示意圖 5ul樣本7.5秒(1) 抗體適

5、當(dāng)過(guò)量 (2) 對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定 45ul樣本(1) 抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段 (2) 反應(yīng)階段(3) 信號(hào)檢測(cè) 2分鐘6分鐘（2+4分鐘）預(yù)反應(yīng)階段反 應(yīng) 階 段BN ProSpec全自動(dòng)特定蛋白分析儀速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測(cè)定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)僅12min即可完成。 (三)速率散射比濁法（rate nephelometry）抗原濃度遞增散射光峰值峰值信號(hào)與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖ABCDFGHI儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)

6、 開(kāi)啟機(jī)器，進(jìn)行定標(biāo) 反應(yīng)階段 抗原過(guò)量檢測(cè) 反應(yīng)時(shí)間（秒）06085散射率抗體過(guò)量抗原過(guò)量第二峰值信號(hào)抗原過(guò)量檢測(cè)第一次峰值信號(hào)加標(biāo)準(zhǔn)抗原(三)方法評(píng)價(jià) 散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過(guò)量檢測(cè)方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴, 對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。1.抗原抗體比例 2.抗體的質(zhì)量 3.增濁劑的使用 （一）免疫比濁分析的影響因素 四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用 4.偽濁度 5.入射光光源和波長(zhǎng) 6.結(jié)果報(bào)告中的計(jì)量單位 7.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制第二節(jié)自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)自動(dòng)化發(fā)光免疫分析儀主要由

7、樣本盤(pán)、試劑盤(pán)(盒)、溫育反應(yīng)系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。 一、吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入氧化劑發(fā)光 信號(hào)檢測(cè) ACS：180 SE和ACSCENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ACS：180 SEACSCENTAURci8200i2000sr 酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過(guò)光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行被測(cè)物的定量。 常用的標(biāo)記酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等

8、。 二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Vitros ECi全自動(dòng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀強(qiáng)生公司 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Access全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCelDxI 800IMMULITE 2000型全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（三）堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀 AXSYM全自動(dòng)酶標(biāo)記熒光免疫分析儀日本東曹的AIA-1800型全自動(dòng)酶標(biāo)記熒光免疫分析儀三、 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定工作示意圖ELECSYS 2010型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Modular Analytics E 模塊170型第三節(jié) 自動(dòng)化熒光免疫分

9、析系統(tǒng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀熒光偏振免疫測(cè)定儀一、時(shí)間分辨熒光免疫分析儀（二）儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn) 抗原抗體結(jié)合 加入Eu3+螯合抗體 加入酸性增強(qiáng)液 4. 信號(hào)檢測(cè) auto DELFIA全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng).美國(guó)EG&GWallac公司1. TRFIA分析用的酸性增強(qiáng)液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污染，使本底升高，所用試劑和器材應(yīng)盡量防塵。 2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動(dòng)裝置，但不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應(yīng)選擇應(yīng)用。 （四）注意事項(xiàng) 二、熒光偏振免疫分析儀偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖熒光偏振免疫測(cè)定工

10、作原理示意圖1. 抗原抗體反應(yīng) 2.偏振熒光強(qiáng)度測(cè)定 （二） 儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標(biāo)記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對(duì)分子量和復(fù)合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾成分。 （三）注意事項(xiàng)第四節(jié) 自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng) 根據(jù)全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動(dòng)酶免分析儀分成二類(lèi)，一類(lèi)為分體機(jī)，一類(lèi)為連體機(jī)。分體機(jī)是由“前處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)酶免分析儀兩個(gè)獨(dú)立的部分組成。連體機(jī)是由多個(gè)模塊組成，使用一臺(tái)計(jì)算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加

11、試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動(dòng)進(jìn)行。條形碼識(shí)別系統(tǒng) 樣本架和加樣系統(tǒng) 試劑架 溫育系統(tǒng) 液路系統(tǒng) 洗板系統(tǒng) 酶標(biāo)板讀數(shù)儀 自動(dòng)裝載傳遞系統(tǒng) 計(jì)算機(jī)管理和信息系統(tǒng) （一）儀器組成和性能回溯到 90 年代初期。 全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)基本特征是單/雙針加樣系統(tǒng)與酶 標(biāo)板處理系統(tǒng)一體化，多數(shù)孵育位置少于 4 塊板。 加標(biāo)本將占用較長(zhǎng)時(shí)間（單針每板需 15 分鐘，三塊板通常需45 分鐘完成加標(biāo)本工作）。全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)的發(fā)展目前，市場(chǎng)上出現(xiàn)的酶免工作站主要有：酶免樣本處理系統(tǒng)酶免后處理系統(tǒng)全自動(dòng)酶免一體機(jī)酶免連體機(jī)。全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)的發(fā)展（二）儀器評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)前處理實(shí)現(xiàn)加樣自動(dòng)化，加樣沒(méi)有瓶

12、頸不能進(jìn)行后續(xù)的酶免實(shí)驗(yàn)部分后處理工作臺(tái)面大小沒(méi)有瓶頸，可以單獨(dú)對(duì)洗板、孵育位置進(jìn)行擴(kuò)充缺少了核心的加樣系統(tǒng)，需要配備前處理實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化一體機(jī)自動(dòng)化程度高，酶免實(shí)驗(yàn)全過(guò)程自動(dòng)化工作臺(tái)面不能無(wú)限制變大，造成處理工作的瓶頸聯(lián)體機(jī)實(shí)際為多個(gè)一體機(jī)進(jìn)行分塊管理，增加了實(shí)驗(yàn)通量占用空間大，性能不夠穩(wěn)定第五節(jié) 免疫自動(dòng)化儀器分析選擇與應(yīng)用一、免疫自動(dòng)化儀器分析選擇原則 實(shí)驗(yàn)室空間和氣候條件 免疫自動(dòng)化儀器檢測(cè)項(xiàng)目的性能指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目檢測(cè)速度要求和設(shè)備配置 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目的經(jīng)濟(jì)效益因素二、免疫自動(dòng)化儀器分析 1、免疫比濁分析法主要用于檢測(cè)免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類(lèi)；補(bǔ)體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白