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1、第二十四章連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性濃度第2頁(yè)教學(xué)目標(biāo)與要求 掌握色素原底物反應(yīng)、脫氫酶參與反應(yīng)和過(guò)氧化物酶參與反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性的原理與方法;ALP、GGT、AMY、ALT、AST、CK、LD、ChE等酶活性的測(cè)定原理及其注意亊項(xiàng)。 熟悉特殊反應(yīng)類型的連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性的原理與方法,四大類連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定除上述酶外,其它酶活性的測(cè)定原理及其注意亊項(xiàng)。 了解上述各酶活性測(cè)定方法的歷史演變及其優(yōu)缺點(diǎn)。第3頁(yè)第3頁(yè)色素原底物反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法脫氫酶參與的連續(xù)監(jiān)測(cè)法過(guò)氧化物酶反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法特殊反應(yīng)類型的連續(xù)監(jiān)測(cè)法主要內(nèi)容第4頁(yè)酶活性濃度的測(cè)定在臨床生化檢驗(yàn)中占有重要的地位,約占測(cè)定總量的1/4到1
2、/3。測(cè)定方法主要有定時(shí)法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法兩種。由于定時(shí)法難以確定在選定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)是否處于線性期,反應(yīng)的時(shí)間都較長(zhǎng),檢測(cè)效率低,因此,臨床大多用連續(xù)監(jiān)測(cè)法來(lái)測(cè)定酶活性濃度。第4頁(yè)第5頁(yè)第5頁(yè)色素原底物反應(yīng)過(guò)氧化物酶參與反應(yīng)脫氫酶參與反應(yīng)特殊反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法第6頁(yè)水解酶類或轉(zhuǎn)移酶類經(jīng)酶促反應(yīng)將無(wú)顏色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物,在一定波長(zhǎng)具有吸收峰,通常把這類底物稱為色素原底物。特點(diǎn)是水解之前無(wú)顏色,水解之后釋放的產(chǎn)物有色。這類底物大多有自行慢慢分解的特點(diǎn),因此要求底物避光保存,檢測(cè)的初始吸光度不能高于0.5。第一節(jié) 色素原底物反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法第7頁(yè)第7頁(yè)堿性磷酸酶測(cè)定一-谷氨?;D(zhuǎn)移酶測(cè)定二淀粉酶測(cè)定
3、三-巖藻糖苷酶測(cè)定四五N-乙酰氨基葡萄糖苷酶測(cè)定六甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶測(cè)定第8頁(yè)一、堿性磷酸酶測(cè)定(alkaline phosphatase,ALP)布氏法: ALP 作用于-甘油磷酸鈉產(chǎn)生磷酸根,定量磷測(cè)定酶活性。少用金-阿法:以磷酸苯二鈉為底物, 經(jīng)ALP作用生成酚,定量酚測(cè)定活性。少用皮-勞法:以4-硝基酚磷酸鈉鹽為底物,水解生成對(duì)硝基酚,堿性條件下呈黃色,連續(xù)監(jiān)測(cè)。第9頁(yè)第9頁(yè)在堿性溶液中ALP催化無(wú)色的4-NPP分裂出磷酸基團(tuán),生成游離的對(duì)硝基苯酚(4-nitrophenol, 4-NP),后者在堿性溶液中轉(zhuǎn)變成醌式結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)較深的黃色。在波長(zhǎng)405nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度增高速率,
4、計(jì)算ALP活性。(二)IFCC推薦的測(cè)定方法第10頁(yè)第10頁(yè)IFCC推薦法以4-NPP為底物,AMP為緩沖液。測(cè)定結(jié)果更可靠,一般不需要做樣品空白對(duì)照,干擾相對(duì)較小。AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)和DEA(二乙醇胺)都是激活型緩沖液,作為底物參與反應(yīng),所測(cè)的的ALP活性要比用碳酸鹽緩沖液高26倍。而DEA的激活作用比AMP更強(qiáng)。因此使用不同緩沖液的方法測(cè)的ALP活性參考區(qū)間不同。注意飲食、抗凝劑、溶血、溫度等的影響。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第11頁(yè)以L-谷氨酰-()-萘胺為底物,生成的()-萘胺與重氮試劑生成紅色化合物。該方法靈敏度低,底物溶解度差,受溶血干擾較大。以L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺(GN
5、A)為底物,雙甘氨酸為谷氨?;氖荏w,產(chǎn)物在堿性環(huán)境下呈黃色,可以連續(xù)監(jiān)測(cè),有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性,但底物溶解度差,現(xiàn)已不推薦。以L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GCNA)為底物,GGT催化生成的對(duì)硝基苯胺在堿性環(huán)境下呈黃色。二、-谷氨?;D(zhuǎn)移酶測(cè)定(-glutamyltransferase, GGT)(一)測(cè)定方法概述第12頁(yè)第12頁(yè)L-谷氨酰-()-萘胺為底物方法靈敏度低,底物溶解度差,受溶血干擾較大-L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺為底物可以連續(xù)監(jiān)測(cè),有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性,但底物溶解度差L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺為底物IFCC推薦方法(一)測(cè)定方法概述第13頁(yè)第13頁(yè)以色素原GCNA為
6、底物,甘氨酰甘氨酸為受體,GGT催化-谷氨?;鶊F(tuán)從GCNA轉(zhuǎn)移至甘氨酰甘氨酸上,并游離出2-硝基-5-氨基苯甲酸。后者的生成量與樣品中的GGT活性成正比關(guān)系,故測(cè)定405nm處的吸光度增量可計(jì)算出GGT的活性。(二)IFCC推薦的測(cè)定方法第14頁(yè)第14頁(yè)GCNA第3位上含有親水基團(tuán)羧基,溶解度增加,而且底物穩(wěn)定性好,自身水解作用小,是IFCC的推薦方法。原IFCC推薦方法的測(cè)定條件pH為8.20,反應(yīng)溫度30;若反應(yīng)溫度37時(shí)最適pH則為7.70,以甘氨酰甘氨酸和氫氧化鈉做緩沖體系;甘氨酰甘氨酸的作用既是緩沖液又可看成是底物,與甘氨酸或甘氨三肽為受體相比,酶促反應(yīng)速度可以提高5倍。(三)方法學(xué)
7、評(píng)價(jià)第15頁(yè)第15頁(yè)2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm的摩爾消光系數(shù)為7.96103(pH為7.70),受pH和溫度影響較大。若選擇401nm或405nm時(shí)需注意校正。由于產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)較小,樣品用量大,樣品體積分?jǐn)?shù)0.0909,為了樣品和反應(yīng)液在37平衡,故需要孵育時(shí)間180s和底物啟動(dòng)模式。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第16頁(yè)以天然淀粉為底物:樣品稀釋法、時(shí)間滴定法、碘淀粉比色法等。但天然淀粉的分子結(jié)構(gòu)與葡萄糖的組成不確定而難以標(biāo)準(zhǔn)化,測(cè)定的準(zhǔn)確性和重復(fù)性都較差,而且線性范圍窄,測(cè)定誤差大。-葡萄糖苷酶-己糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)法是最早使用的連續(xù)監(jiān)測(cè)法。以人工合成的麥芽寡糖苷為底物的測(cè)
8、定方法,例如對(duì)硝基酚麥芽庚苷法,目前最為常用。三、淀粉酶測(cè)定(-Amylase, AMS)(一)方法概述第17頁(yè)第17頁(yè)以2-氯-對(duì)硝基苯酚麥芽三糖苷( CNP-G3 )為底物,被淀粉酶水解釋放出2-氯-對(duì)硝基酚(CNP)。淀粉酶水解CNP-G3的速度是G3的10倍,因而不需要用輔助酶,直接水解產(chǎn)生CNP在405nm有光吸收,該法準(zhǔn)確性較好。從理論上說(shuō)這是一種最理想的測(cè)定方法,但易受內(nèi)源性-葡萄糖苷酶的干擾。尿標(biāo)本中細(xì)菌污染偶爾會(huì)干擾反應(yīng)。(一)方法概述第18頁(yè)第18頁(yè)以對(duì)硝基酚麥芽庚苷(4-NP-G7)為底物,經(jīng)AMS催化水解為游離的寡糖(G5,G4,G3)及葡萄糖殘基減少的對(duì)-硝基苯酚寡糖
9、苷(4-NP-G2、4-NP-G3和4-NP-G4)。后者在-葡萄糖苷酶催化下,進(jìn)一步水解為葡萄糖和對(duì)-硝基酚(其摩爾數(shù)僅為酶解底物4-NP-G7的1/3,其余2/3還結(jié)合在4-NP-G4中)。對(duì)-硝基酚的生成量在一定范圍內(nèi)與-淀粉酶活性成正比。(二)常用方法第19頁(yè)第19頁(yè)用半乳糖-2-氯-4-硝基苯酚-麥芽糖做底物,評(píng)價(jià)基本與CNP-G3一樣,而且不受內(nèi)源性-葡萄糖苷酶的干擾。明顯的溶血會(huì)使結(jié)果偏低,而高濃度的免疫球蛋白(Ig G50g/L)會(huì)對(duì)結(jié)果帶來(lái)正向干擾。不管用何種方法,脂性血清中脂蛋白會(huì)導(dǎo)致AMS結(jié)果偏低。另外,臨床中還應(yīng)注意巨淀粉酶血癥的存在,輸注的羥乙基淀粉或右旋糖酐會(huì)導(dǎo)致巨
10、型復(fù)合物的產(chǎn)生。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第20頁(yè)第20頁(yè)1.羥乙基呱嗪乙硫磺酸緩沖系統(tǒng)中pH升高硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)也增大。不同的蛋白質(zhì)體系中摩爾消光系數(shù)也有變化。2.-葡萄糖苷酶對(duì)底物有緩慢的水解作用,若將PNP-G7的非還原端葡萄糖殘基接上保護(hù)基團(tuán)封閉,就可以阻止這種水解作用,穩(wěn)定性可提高59倍。3.多功能-葡萄糖苷酶對(duì)PNP-G7的所有降解產(chǎn)物都有相同的轉(zhuǎn)換率,可以直接用PNP的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算酶活性。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第21頁(yè)連續(xù)監(jiān)測(cè)法4-硝基酚-L-巖藻吡喃糖苷底物法放免法熒光法(一)方法概述三、-巖藻糖苷酶測(cè)定(alpha-L-fucosidase,AFU)第22頁(yè)AFU作用于2-Chlo
11、ro-4-nitrophenyl- alpha-L- fucopyranoside(CNPF)生成2-氯-4-硝基酚(CNP)和-L-巖藻吡喃糖。405nm波長(zhǎng)處吸光度的上升速率與AFU的活性成正比,即可計(jì)算出樣品中AFU的活性。(二)常用方法第23頁(yè)第23頁(yè)CNPF法所采用CNP的解離常數(shù)(pKa)5.5與AFU的最適pH相近,縮短了反應(yīng)時(shí)間,無(wú)需樣本空白,實(shí)現(xiàn)了AFU的連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定。提高pH可提高CNP的離子化率,但過(guò)高的pH會(huì)影響酶活性;該方法操作簡(jiǎn)便,測(cè)定時(shí)間短,靈敏度及抗干擾性都有所提高。溶血仍有干擾。測(cè)定可用血清或適量EDTA-Na2和草酸鈉抗凝的血漿,肝素和 檸檬酸鹽抗凝劑不可
12、使用。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第24頁(yè)第24頁(yè)P(yáng)NP-NAG法:CPR-NAG法:固定時(shí)間法:對(duì)硝基酚葡萄糖苷法MCG-葡萄糖苷法4-甲基傘形酮基乙酰氨基葡萄糖苷熒光法五、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶測(cè)定(一)方法概述第25頁(yè)第25頁(yè)以2-氯-4- 硝基酚-N-乙酰- beta-D-氨基葡萄糖苷為底物,在NAG催化下水解產(chǎn)生CNP,色素原的pKa為5.5,與NAG酶的最適pH4.6相近,在反應(yīng)條件下色原呈色不需要加堿性呈色劑,反應(yīng)進(jìn)入線性期時(shí)通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)405nm處吸光度的變化,用摩爾吸光系數(shù)法計(jì)算酶活力單位。(二)常用方法第26頁(yè)第26頁(yè)CNP的pKa為5.5,與NAG的最適pH一直,且有足夠大的摩爾消光
13、系數(shù),可以直接速率法分析,無(wú)需樣品空白,但底物溶解性差,穩(wěn)定性不夠,非酶水解較明顯。pH 7.0時(shí)CNP離子化率97%,pH 5.0時(shí)只有25%左右,因此吸光度約為PNP法的1/4,而且離子化程度受pH影響較大,建議在臨床使用中,實(shí)際測(cè)定摩爾吸光系數(shù),計(jì)算分析儀的K值,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第27頁(yè)GDPA早期采用甘氨酰-L-脯氨酸-2-萘酰胺作為底物,由于萘酰胺具有致癌作用而少用?,F(xiàn)發(fā)展了以甘氨酰脯氨酰對(duì)硝基苯胺建立起來(lái)的方法有連續(xù)監(jiān)測(cè)法、非連續(xù)的直接比色法和間接比色法,其中以連續(xù)監(jiān)測(cè)法最為方便快捷熒光法:靈敏度較高,可用于尿液中GPDA的測(cè)定。六、甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶測(cè)
14、定(glycylproline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA)(一)方法概述第28頁(yè)第28頁(yè)GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰對(duì)硝基苯胺水解,生成甘氨酰脯氨酸和黃色的對(duì)硝基苯胺,后者在405nm波長(zhǎng)下吸光度的升高,吸光度升高速率與GPDA活性成正比。(二)常用方法第29頁(yè)第29頁(yè)連續(xù)監(jiān)測(cè)法具有簡(jiǎn)便快速,重復(fù)性好,線性范圍寬,敏感性高,結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。底物穩(wěn)定易溶,檢測(cè)試劑為液體雙試劑,沒(méi)有非酶水解現(xiàn)象,使用非常方便。試劑需放28儲(chǔ)存,避免冷凍、污染,否則將導(dǎo)致失效。GPDA檢測(cè)的最適pH為8.6,有研究認(rèn)為在pH7.98.9之間,隨反應(yīng)液pH的升高,底物的自然水解顯著
15、加快,試劑空白速率明顯增加。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第30頁(yè)第30頁(yè)檢測(cè)340nm吸光度變化速率,反映了NAD(P)H的生成或消耗速度,從而可直接測(cè)定氧化還原酶;也可利用酶偶聯(lián)反應(yīng),間接測(cè)定以氧化還原酶做指示反應(yīng)的酶活性。NADPH或NADH不穩(wěn)定,在含有NADPH或NADH的試劑中,由于配制或保存的原因使他們會(huì)被氧化,吸光度降低,因此在使用時(shí)要求初始吸光度不能低于0.9。第二節(jié) 脫氫酶參與的連續(xù)監(jiān)測(cè)法第31頁(yè)第31頁(yè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定一門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定二肌酸激酶測(cè)定三肌酸激酶同工酶測(cè)定四五乳酸脫氫酶測(cè)定第32頁(yè)第32頁(yè)ALT測(cè)定丙酮酸賴氏法偶聯(lián)丙酮酸氧化酶法IFCC推薦法測(cè)定谷氨酸酶電極法一
16、、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定(alanine aminotransferase, ALT)(一)方法概述第33頁(yè)第33頁(yè)該法屬于酶偶聯(lián)法,LD為指示酶,連續(xù)監(jiān)測(cè)NADH在340nm的吸光度下降速度來(lái)計(jì)算酶活性。該法也是我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)的推薦方法。(二)常用方法第34頁(yè)IFCC推薦方法將測(cè)定溫度30修改為37,將-酮戊二酸的用量從2mmol/L提高到15mmol/L,基本滿足了最大反應(yīng)速度對(duì)-酮戊二酸的用量要求,擴(kuò)大了測(cè)定范圍,提高了測(cè)定準(zhǔn)確性。特別規(guī)定:LD應(yīng)用兔肌來(lái)源的干粉制劑,不能選用硫酸銨懸浮液;可加入清蛋白和疊氮鈉來(lái)保持其活性;但酶制劑和清蛋白中應(yīng)沒(méi)有GLDH和ALT的污染。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第3
17、5頁(yè)第35頁(yè)缺點(diǎn):內(nèi)源性丙酮酸和GLDH的干擾,采用雙試劑底物啟動(dòng)模式可以消除部分干擾,延長(zhǎng)延滯期也可以消除部分干擾,要求用高純度的試劑和無(wú)氨蒸餾水。IFCC推薦法建議試劑中添加5磷酸砒哆醛,這與我國(guó)推薦方法不同。5磷酸砒哆醛可使脫輔基的酶恢復(fù)酶活性,對(duì)腫瘤化療病人和腎病病人(有一部分脫輔基的酶)來(lái)說(shuō),與不含有輔酶的試劑相比測(cè)得結(jié)果有明顯差別。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第36頁(yè)第36頁(yè)AST的檢測(cè)方法和ALT基本相同,有賴氏法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法。IFCC推薦的連續(xù)監(jiān)測(cè)法用蘋果酸脫氫酶(MD)做指示酶。賴氏法簡(jiǎn)便易行,不需要特殊設(shè)備,曾被廣泛使用。但是草酰乙酸對(duì)AST有反饋抑制作用,使結(jié)果偏低,不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分
18、析。二、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定(asparate aminotransferase, AST)(一)方法概述第37頁(yè)第37頁(yè)(二)IFCC推薦方法 該方法也是屬于酶偶聯(lián)法,以MD做指示酶,連續(xù)監(jiān)測(cè)NADH在340nm的吸光度下降速度來(lái)計(jì)算酶活性。該法是我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)的推薦方法。第38頁(yè)第38頁(yè)IFCC推薦法用蘋果酸脫氫酶做指示酶,由于產(chǎn)物草酰乙酸不穩(wěn)定,易轉(zhuǎn)變?yōu)楸?,故試劑中加入LD,實(shí)質(zhì)是兩個(gè)指示酶,但通常將LD做為輔助酶。該法預(yù)孵育期較長(zhǎng),達(dá)90s,目的是在預(yù)孵育期將內(nèi)源性的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,減少內(nèi)源性丙酮酸的干擾。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第39頁(yè)第39頁(yè)化學(xué)發(fā)光法熒光法比色法連續(xù)監(jiān)測(cè)法肌酸激酶測(cè)
19、定(creatinine kinase, CK)三、肌酸激酶測(cè)定(creatinine kinase, CK)(一)方法概述第40頁(yè)第40頁(yè)以n-乙酰半胱氨酸(NAC)做激活劑,偶聯(lián)HK,以G6PD做指示酶,連續(xù)監(jiān)測(cè)NADPH在340nm的吸光度上升速度來(lái)計(jì)算酶活性。該法也是我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)的推薦方法。(二)IFCC推薦方法第41頁(yè)第41頁(yè)酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法:反應(yīng)速度快,不需做血清空白,在臨床廣泛使用。1.巰基激活物 CK是巰基酶,常用NAC、谷胱甘肽和巰基乙醇做激活劑,但應(yīng)注意試劑純度。同時(shí)用乙二胺四乙酸絡(luò)合二價(jià)鈣離子,防止NAC由于二價(jià)離子催化發(fā)生的氧化,從而增加反應(yīng)混合物的穩(wěn)定性。(三)方法學(xué)
20、評(píng)價(jià)第42頁(yè)第42頁(yè)2.腺苷酸激酶(AK)的干擾和消除 紅細(xì)胞含有大量adenylate kinase使CK活性假性增高。測(cè)定時(shí)常AP5A和AMP兩種AK抑制劑聯(lián)合使用。3延滯期 25C 110s、30C 90s和37C 60s。4線性 測(cè)定線性最低可達(dá)3000U/L,高于此值時(shí)用150mmol/L的氯化鈉溶液稀釋后再測(cè)定。由于血清中的抑制物也被稀釋,稀釋后的測(cè)定結(jié)果比原結(jié)果偏高。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第43頁(yè)第43頁(yè)電泳法:該方法準(zhǔn)確性、精密度和靈敏度都較差,且費(fèi)時(shí),操作繁瑣,電泳的高溫也會(huì)使CK活性下降。免疫抑制法:試劑中含有抗CK-M亞基的抗體,使CK-MM 100%被抑制,CK-MB則有50
21、%被抑制,若不考慮CK-BB的含量,抑制后的酶活性乘2就是原來(lái)CK-MB的酶活性。離子交換層析法:操作比較繁瑣,臨床應(yīng)用較少。四、肌酸激酶同工酶測(cè)定(一)方法概述第44頁(yè)肌酸激酶同工酶測(cè)定離子交換層析法電泳法免疫抑制法(一)方法概述第45頁(yè)第45頁(yè)免疫抑制和酶動(dòng)力學(xué)結(jié)合具有快速、準(zhǔn)確和特異的優(yōu)點(diǎn)。免疫抑制法是基于血清中CK-BB的量很低,如果CK-BB的量很高會(huì)帶來(lái)巨大的誤差。巨CK不含有CK-M亞單位,不發(fā)生免疫抑制,如同CK-MB而錯(cuò)誤地被測(cè)定,以致測(cè)得活性超過(guò)樣本中總CK活性。CK-MB質(zhì)量的測(cè)定分析靈敏度高,真實(shí)的反應(yīng)血清中CK-MB的量,目前普遍采用,也是AMI診療指南推薦的方法。(
22、三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第46頁(yè)第46頁(yè)連續(xù)監(jiān)測(cè)法:以正向反應(yīng)(LP)應(yīng)用較為廣泛,是IFCC和我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)的推薦方法。比色法:用2,4-二硝基苯肼顯色測(cè)定丙酮酸生成量或以吩嗪甲酯硫酸鹽或心肌黃酶為電子傳遞體,使四唑藍(lán)還原成藍(lán)色染料后比色測(cè)定NADH生成量。熒光法:靈敏度高,需特殊儀器,在臨床常規(guī)中應(yīng)用少五、乳酸脫氫酶測(cè)定(lactate dedhydrogenase, LD)(一)方法概述第47頁(yè)第47頁(yè)正向反應(yīng)(LP )連續(xù)監(jiān)測(cè)法是IFCC和我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)的推薦方法,有酶有證參考物質(zhì)。 1.(L-P)2.(P-L):(二)常用方法第48頁(yè)第48頁(yè)正向反應(yīng)優(yōu)點(diǎn):乳酸和NAD很穩(wěn)定,NAD含抑制LD的雜質(zhì)
23、少,乳酸對(duì)LD的抑制作用小,線性范圍較寬。缺點(diǎn):需高底物濃度,反應(yīng)速度較慢。逆向反應(yīng)優(yōu)點(diǎn):NADH用量少,試劑成本低,反應(yīng)速率快,靈敏度高缺點(diǎn):丙酮酸和NADH的穩(wěn)定性差;過(guò)量丙酮酸對(duì)LD的抑制作用大。NADH種類、純度和來(lái)源對(duì)酶反應(yīng)速度有明顯的影響。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第49頁(yè)第49頁(yè)氨羧基甲酸是LD的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,草酸鹽是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,高濃度的尿素能使LD分子解聚或破壞酶蛋白二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu),使酶完全失活,低濃度的尿素是LD的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第50頁(yè)第50頁(yè)第三節(jié) 過(guò)氧化物酶反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法過(guò)氧化物酶(peroxidase , POD)是以過(guò)氧化物為電子受體催化底物氧化的酶,被測(cè)
24、物質(zhì)通過(guò)酶作用產(chǎn)生的H2O2,在4-AAP和POD的存在下,可生成紅色醌亞胺化合物,也叫Trinder反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是可在可見(jiàn)光范圍內(nèi)比色,可以連續(xù)監(jiān)測(cè),易于自動(dòng)化,因此具有比較重要的使用價(jià)值。Trinder反應(yīng)的過(guò)氧化物酶對(duì)底物專一性差,維生素C、尿酸、谷胱甘肽及膽紅素等還原性物質(zhì)對(duì)反應(yīng)有干擾。第51頁(yè)第51頁(yè) 脂肪酶測(cè)定一 5-核苷酸酶測(cè)定二 腺苷脫氨酶測(cè)定三第52頁(yè)測(cè)定LPS的實(shí)際質(zhì)量雙抗體夾心免疫分析法、乳膠凝集法測(cè)定底物的減少量如比濁法、擴(kuò)散法等測(cè)定產(chǎn)物(游離脂肪酸)的增加如滴定法、比色法、分光光度法、熒光法和pH電極法等一、脂肪酶 測(cè)定(一)方法概述第53頁(yè)第53頁(yè)檢測(cè)波長(zhǎng)550nm(
25、二)常用方法第54頁(yè)第54頁(yè)酶偶聯(lián)顯色比色法特異性高,雙試劑能消除內(nèi)源性甘油的干擾問(wèn)題,但高濃度的膽紅素會(huì)使結(jié)果偏低10%15%。甘油三酯和膽固醇(包括HDL-C和LDL-C)測(cè)定試劑盒成分中均含有脂肪酶,檢測(cè)中可能存在交叉污染。由于原理、試劑和測(cè)定方法不同,各種方法的結(jié)果相差很大。在使用校準(zhǔn)品時(shí)一定選擇相應(yīng)方法的相應(yīng)值。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第55頁(yè)二、5-核苷酸酶測(cè)定(5-nucleotidase, 5-NT)磷比色法測(cè)定生成氨的量Kalckar氏連續(xù)監(jiān)測(cè)法5-NT偶聯(lián)PNP、XOD、過(guò)氧化氫酶和醛脫氫酶偶聯(lián)腺苷酶和谷氨酸脫氫酶連續(xù)監(jiān)測(cè)法(一)方法概述第56頁(yè)第56頁(yè)檢測(cè)波長(zhǎng)510nm(二)常用
26、方法第57頁(yè)第57頁(yè)借助過(guò)氧化氫酶的縮合反應(yīng),檢測(cè)產(chǎn)物上升的速率的方法克服了血清空白高的問(wèn)題,但試劑成本高。該方法易受血清中氧化還原性物質(zhì)如維生素C的干擾, 如果試劑中加入抗壞血酸氧化酶即可消除這種干擾。高濃度膽紅素和溶血會(huì)干擾測(cè)定。由于紅細(xì)胞內(nèi)含有較大量的5-核苷酸酶,因此溶血會(huì)使測(cè)定結(jié)果偏高。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第58頁(yè)三、腺苷脫氨酶測(cè)定(Adenosine deaminase, ADA)Kaplan法Kalckar氏法奈氏顯色法、PAGE活性染色法、波氏比色法、氨氣敏電極法、ADA偶聯(lián)GLDH反應(yīng)PNP法(一)方法概述第59頁(yè)第59頁(yè)檢測(cè)波長(zhǎng)550nm(二)常用方法第60頁(yè)第60頁(yè)反應(yīng)抗干擾
27、能力強(qiáng),適合自動(dòng)化快速測(cè)定。但該法準(zhǔn)確度不夠高,因?yàn)猷堰屎塑樟姿峄福≒NP)和黃嘌呤氧化酶(XTO)溶液中含有的硫酸氨可造成ADA活性下降,使測(cè)定值偏高。該方法易受血清中氧化還原性物質(zhì)如維生素C的干擾,如果試劑中加入抗壞血酸氧化酶即可消除這種干擾。高濃度膽紅素和溶血的干擾也應(yīng)該注意。(三)方法學(xué)評(píng)價(jià)第61頁(yè)第61頁(yè)第四節(jié) 特殊反應(yīng)類型的連續(xù)監(jiān)測(cè)法定時(shí)法是在酶促反應(yīng)終止后加入另一個(gè)試劑與底物或產(chǎn)物反應(yīng),轉(zhuǎn)化為有色化合物。也有個(gè)別酶不終止反應(yīng),直接加入與酶促反應(yīng)無(wú)關(guān)的試劑,與酶促反應(yīng)的某一產(chǎn)物反應(yīng)生成有特征性的化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測(cè)。表面上看類似人工合成底物,但實(shí)際上是利用某些特殊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測(cè)。第62頁(yè)第62頁(yè) 膽堿酯酶測(cè)定一 酸性磷酸酶測(cè)定二第63頁(yè)Add TitleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleC
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