分子生物實(shí)驗(yàn)課件：質(zhì)粒DNA的提取

1、質(zhì)粒DNA的提取和電泳鑒定掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。了解實(shí)驗(yàn)中所使用試劑的作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕驹韷A裂解法是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來達(dá)到分離的目的。染色體DNA質(zhì)粒DNA 當(dāng)菌體在NaOH-SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA會發(fā)生變性。加入中和液（乙酸鉀）后，質(zhì)粒DNA分子分子量小，能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；而染色體DNA、大分子RNA分子量大，不易復(fù)性，和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成沉淀，可通過離心去除。基本原理具體步驟取1.5ml對數(shù)生長期的菌體于Eppendorf管中，8000rpm離心1min，收集菌體。棄上清液，將EP管倒置在

2、吸水紙上，吸干溶液。加入100ul GTE緩沖液，輕輕吹打重懸菌體，室溫放置5min。加入200ul新鮮配制的NaOH-SDS（100ul 2mol/L NaOH+100ul 10%SDS+800ul 雙蒸水）溶液，上下輕輕翻動EP管，顛倒混勻10次，冰浴2-3min。動作輕柔，同時控制好時間！加入150ul預(yù)冷的乙酸鉀溶液，充分顛倒混勻，冰浴5min。一定要充分混勻！4，12000rpm離心10min，取上清300ul 轉(zhuǎn)移至另一支新的EP管中。加180ul異丙醇，冰浴20min，12000rpm離心5min，輕輕倒棄上清液。緩慢加入70%乙醇0.5ml，輕輕上下顛倒， 12000rpm離心

3、1min，輕輕倒棄大部分上清，揮干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！用30ul 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 水浴10min，4 保存。配制1%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖粉末+100mlTAE緩沖液+5ul 10mg/ml EB。上樣6ul（5ul 質(zhì)粒DNA+1ul 6Loading Buffer），120V穩(wěn)壓電泳鑒定質(zhì)粒DNA。預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)粒DNA在正常情況下以共價閉合環(huán)狀cccDNA構(gòu)型（超螺旋scDNA）存在，在提取過程中由于機(jī)械力、酸堿度等原因，可能會使DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）；開環(huán)DNA（ocDNA）

4、；線性DNA（LDNA）。LDNAocDNAcccDNA電泳方向注意事項(xiàng)NaOH-SDS溶液處理時間不能太長，且不能激烈震蕩，否則會斷裂基因組DNA使之混入質(zhì)粒DNA中。加入預(yù)冷乙酸鉀后要充分顛倒混勻，以中和NaOH，沉淀蛋白質(zhì)和染色體DNA等。70%乙醇洗滌時不要吹打質(zhì)粒DNA沉淀，否則DNA會溶解在水中。同時DNA沉淀不能太過干燥，否則影響TE溶液溶解。配制瓊脂糖凝膠和電泳時，注意防護(hù)安全，不要將電泳使用過的手套帶出電泳房。掌握內(nèi)容NaOH-SDS溶液和乙酸鉀溶液的成分、作用以及操作注意事項(xiàng)？質(zhì)粒DNA的三種構(gòu)型以及電泳條帶分布？實(shí)驗(yàn)和作業(yè)要求2人一份標(biāo)本，6人一組。實(shí)驗(yàn)報告在下次實(shí)驗(yàn)課前

5、由班長統(tǒng)一收齊上交。實(shí)驗(yàn)報告：原理（不要照抄實(shí)驗(yàn)手冊） 實(shí)驗(yàn)方法（可附加流程圖） 結(jié)果（電泳鑒定需要附圖） 討論（實(shí)驗(yàn)失敗要分析原因）分子克隆技術(shù)分：分離目的基因。（實(shí)驗(yàn)一）切：限制酶切割目的基因與載體。（實(shí)驗(yàn)二）接：拼接重組體。（實(shí)驗(yàn)二）轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)入受體菌。（實(shí)驗(yàn)三）篩：篩選重組體。（實(shí)驗(yàn)三） 試劑中的主要成分和作用GTE緩沖液（重懸液、一液）：Tris-HCl溶液：調(diào)節(jié)pH。葡萄糖：使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子底部。EDTA：二價金屬離子螯合劑，抑制DNase活性。返回NaOH-SDS溶液（裂解液、二液）：NaOH：溶解細(xì)胞，破壞核酸堿基配對使氫鍵斷裂從而讓核酸變性。SDS（十二烷基硫酸鈉）：裂解細(xì)胞，結(jié)合蛋白質(zhì)使其變性，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。返回乙酸鉀溶液（中和液、三液）：乙酸：中和NaOH，使質(zhì)粒DNA復(fù)性為可溶性DNA，染色體DNA分子長，分子量大，難以復(fù)性。鉀離子：置換了SDS的鈉離子形成不溶性的PDS，將基因組DNA和蛋白