胎盤(pán)因子的制備及其對(duì)淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的體外研究

1、胎盤(pán)因子的制備及其對(duì)淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的體外研究【摘要】為了建立制備胎盤(pán)因子plaentafatr,PF的新方法，研究PF理化性質(zhì)，并討論P(yáng)F體外應(yīng)用對(duì)淋巴細(xì)胞的影響，應(yīng)用超濾法制備PF，對(duì)PF的含量及各種成分的分子量進(jìn)展測(cè)試，并以環(huán)孢素A(sA)為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水(NS)為陰性對(duì)照。應(yīng)用甲基噻唑基四唑TT法檢測(cè)植物血凝素PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖及混合淋巴細(xì)胞反響LR；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞D69的表達(dá)；應(yīng)用乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定自然殺傷NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞K562的殺傷作用。結(jié)果說(shuō)明反響的作用與環(huán)孢菌素AsA相當(dāng)P0.05。PF和sA均可下調(diào)佛波酯PA+離子霉素inyin刺激后T淋巴細(xì)胞活

2、化抗原D69的表達(dá)PFvssA,P0.05。細(xì)胞殺傷試驗(yàn)顯示，PF組NK細(xì)胞殺傷活性略高于或等于NS組P0.05，而sA組殺傷活性明顯低于NS組P0.05。結(jié)論：建立了制備PF的新方法，并首次證實(shí)PF在體外對(duì)T細(xì)胞有強(qiáng)大的免疫抑制作用，可抑制由絲裂原及異基因抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖及活化，而且并不影響甚或促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。這一結(jié)果說(shuō)明，PF在抑制移植物抗宿主病GVHD的同時(shí)，或答應(yīng)以較好地保存移植物抗腫瘤效應(yīng)GVT，是一種較理想的、有應(yīng)用潛能的抗GVHD制劑?！娟P(guān)鍵詞】胎盤(pán)因子淋巴細(xì)胞環(huán)孢菌素AT細(xì)胞；NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用PreparatinfPlaentaFatrandItsIun

3、regulatryEffetsnLyphytesInVitrKeyrdsplaentafatr;lyphyte;ylsprinA;Tell;naturalkillerell;iunregulutryeffetJExpHeatl2022;15(3):567-572胎盤(pán)組織功能復(fù)雜，是母體和胎兒之間的免疫屏障。許多學(xué)者證實(shí)，胎盤(pán)中的大分子蛋白胎盤(pán)球蛋白，以及胎盤(pán)組織培養(yǎng)上清、胎盤(pán)提取物等蛋白質(zhì)成分的混合物，均可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖與活化1-4。胎盤(pán)因子plaentafatr,PF亦稱胎盤(pán)肽，是從人胎盤(pán)組織中提取的小分子多肽類物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)作用5，并且在臨床上用于治療惡性腫瘤、病毒性肝炎、支氣管

4、哮喘及變應(yīng)性鼻炎等病也獲得了較好的療效6-10，但PF的制備一直沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化，亦無(wú)商品消費(fèi)化。本研究建立制備PF的新方法，討論P(yáng)F的理化性質(zhì)及生物學(xué)活性，比擬其與傳統(tǒng)的免疫抑制劑環(huán)孢菌素AylsprinA,sA對(duì)T細(xì)胞及NK細(xì)胞的影響。材料安康產(chǎn)婦胎盤(pán)，由北京大學(xué)人民醫(yī)院產(chǎn)科提供。搜集要求：于產(chǎn)后立即搜集或不超過(guò)12小時(shí)，去除筋膜血管、生理鹽水沖凈、剪碎備用。另外，提供胎盤(pán)的產(chǎn)婦均為產(chǎn)前乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、弓形蟲(chóng)及梅毒檢測(cè)均為陰性的安康產(chǎn)婦。主要試劑及儀器PF的制備應(yīng)用超濾法制備PF參考黃楚華的報(bào)道11，并做了重要改動(dòng)。步驟如下：胎盤(pán)剪碎、加2倍生理鹽水/V，高速勻漿2380g，

5、3分鐘/次10次，37水浴孵育1小時(shí)，113g離心30分鐘，上清液超濾截留分子量10kD，產(chǎn)物用illipre濾器220過(guò)濾除菌分裝得到PF。理化性質(zhì)研究蛋白質(zhì)定性試驗(yàn)采用加熱醋酸法及20%磺基水楊酸法進(jìn)展蛋白質(zhì)定性試驗(yàn)。多肽質(zhì)量的測(cè)定采用Bradfrd法進(jìn)展多肽質(zhì)量的測(cè)定。計(jì)算公式為：多肽質(zhì)量(g/g)=多肽質(zhì)量濃度提取液總體積測(cè)定時(shí)取樣體積胎盤(pán)組織質(zhì)量生物學(xué)活性研究淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞PBN接種96孔板，參加終濃度10g/l的PHA和不同制劑。試驗(yàn)分3組：不同稀釋度的PF1/1,1/2,1/4,1/6,1/8及1/10組、不同濃度的sA組及生理鹽水nralsaline,NS組

6、，同時(shí)設(shè)立單純培養(yǎng)液及未加PHA的對(duì)照孔。于37、5%2孵箱中培育68小時(shí)，應(yīng)用TT法檢測(cè)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率%=1-試驗(yàn)孔D值無(wú)刺激孔D值100混合淋巴細(xì)胞反響不同志愿者的PBN分別作為反響細(xì)胞和刺激細(xì)胞，刺激細(xì)胞以絲裂霉素終濃度60g/l處理，將反響細(xì)胞與刺激細(xì)胞按11接種96孔板，參加不同制劑。分組情況同上，并設(shè)立單純反響細(xì)胞、單純刺激細(xì)胞及單純培養(yǎng)基的對(duì)照孔，于37、5%2孵箱中培育6天，應(yīng)用TT法檢測(cè)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率同上。NK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)PBN接種于24孔板為效應(yīng)細(xì)胞，參加不同制劑。試驗(yàn)分3組：不同稀釋度的PF1/1,1/2,1/4,1/6,1/8及1/10組、不

7、同濃度的sA組及NS組。于37、5%2孵箱培育12小時(shí)，取出效應(yīng)細(xì)胞，重新計(jì)數(shù)接種96孔板。K562細(xì)胞株接種于96孔板作為靶細(xì)胞，效靶比201，并設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、體積校正釋放孔及培養(yǎng)基空白對(duì)照孔。余步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)展，酶標(biāo)儀檢測(cè)D490，并計(jì)算細(xì)胞殺傷率%。公式為：細(xì)胞殺傷率=A-B-/D-100式中A=試驗(yàn)孔D值空白對(duì)照孔D值，B=效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔D值空白對(duì)照孔D值，=靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔D值空白對(duì)照孔D值，D=靶細(xì)胞最大釋放孔D值體積校正孔D值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SD表示，2個(gè)以上樣本均數(shù)的比擬采用方差分析F檢驗(yàn)

8、，多個(gè)樣本兩兩比擬采用q檢驗(yàn)LSD法，P0.05者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果理化性質(zhì)PF外觀呈微黃色透明液體，pH6.8。加熱醋酸法及20%磺基水楊酸法蛋白質(zhì)定性為陰性。多肽質(zhì)量以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的D590對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度作圖，得到回歸方程，多肽質(zhì)量濃度(y)=0.4591.608D590(x)，R2=0.847，P=0.001，根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的D590，按回歸方程求出PF的多肽質(zhì)量為5.70-6.86g/g鮮重胎盤(pán)6.280.58g/g。生物學(xué)活性對(duì)PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖及混合淋巴細(xì)胞反響的影響PF對(duì)PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系圖1，隨PF稀釋度增加，抑

9、制作用逐漸減弱各劑量組與NS組比擬P=0.000，其中1/1、1/2及1/43個(gè)劑量組與sA組比擬分別為70.03%vs67.91%P=0.401;67.80%vs67.23%P=0.744及59.33%vs67.34%P=0.104。PF對(duì)混合淋巴細(xì)胞反響也具有顯著的抑制作用，亦呈劑量依賴關(guān)系圖2。隨PF稀釋度增加，抑制作用逐漸減弱各劑量組與NS組比擬P=0.000，其中1/1、1/2、1/4及1/64個(gè)劑量組與sA組比擬分別為78.90%vs72.96%P=0.708;78.70%vs73.43%P=0.599;73.04%vs73.54%P=1.000及66.02%vs74.25%P=0.469。上述結(jié)果說(shuō)明，PF在體外抑制PHA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖和混合淋巴細(xì)胞反響的作用與sA相當(dāng)。討論本研究建立了一種制備PF的新方法，并首次證實(shí)PF體外應(yīng)用對(duì)T細(xì)胞有強(qiáng)大的免疫抑制作用