基因工程復(fù)習(xí)樣本

1、基因工程（分子克隆技術(shù)）:指將一種供體生物體的目的基因與適宜的載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種受體生物體內(nèi)，使之按照人們的意愿 穩(wěn)定遺傳并表示出新的基因產(chǎn)物或產(chǎn)生新的遺傳性狀的DNA體外操作程序?；蚬こ痰幕玖鞒蹋?.流程圖限制性核酸內(nèi)切酶1）目的基因的分離、獲取與制備2）目的基因與載體連接構(gòu)建成為重I組載體分子3）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞4）外源目的基因陽性克隆的鑒定和 篩選5）外源目的基因的表示II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性:（1）識別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的特定序列（2）識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)（3）大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)同位酶： 識別

2、相同的序列但切割位點不一樣。（如Sma I和Xma I,識 別的序列相同，都為CCCGGG,而切割位置不同，Sma I為錯切C ! CCGGG,而 Xma I 為平切 CCC IGGG。）同尾酶：識別位點不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。P17同裂酶：來源不同，識別位點和切割位點均相同的酶。星號活性： 限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點是在特定的消化條件下測定的， 當(dāng)條件改變時，有些酶的識別位點也隨之改變，可能切割一些與特異識別序列 相類似的序列，這種現(xiàn)象稱為星號活性。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素(6):溫度，鹽離子濃度，緩沖體系，反 應(yīng)體積和甘油濃度，限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的時間，DNA的純

3、度和結(jié)構(gòu)載體：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體?；蚬こ虒d體的要求：分子量較小，可容納較大的外源基因片段?？截悢?shù)較高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。 具有選擇標(biāo)記，Ampr、Tetr、Kanr等。具有較多的限制性酶切位點，易插入外源基因DNA片段具有復(fù)制起始點，在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨立復(fù)制具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性。具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。10.菌落藍(lán)白斑選擇的原理：在基因克隆時，細(xì)菌在含有IPTG和x gal的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。IPTG 誘導(dǎo)質(zhì)粒的lacz基因產(chǎn)生a-肽，同時誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶的羧基端片段。 兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使x g

4、al水解，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使非 重組菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。(2)當(dāng)外源基因插到質(zhì)粒的多克隆位點后，使lacz失 活，不能表示a-肽，破壞了互補(bǔ)作用，細(xì)胞內(nèi)無有活性半乳糖苷酶，使帶有 重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落?；蛭膸欤?將某種生物細(xì)胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并 將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論 上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因?；蛭膸鞓?gòu)建：細(xì)胞染色體大分子DNA的提取和大片段DNA的制備載體DNA的準(zhǔn)備載體與外源大片段DNA的連接體外包裝及基因組DNA文庫的擴(kuò)增重組DNA的篩選和鑒定cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA

5、,再將這些cDNA與載體連接,轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫。構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟:(1)總RNA( total RNA)提取 (2) mRNA的分離純化(3) cDNA的合成(4) cDNA與載體連接(5)雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖15.重疊延伸法定點突變技術(shù):P87利用PCR反應(yīng)在體外合成和體外引入引物 的特點，能夠利用PCR技術(shù)介導(dǎo)定點突變 的發(fā)生。改進(jìn)的思路：設(shè)計4個引物組成三 對組合相繼進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增。核酸分子雜交檢測原理: 根據(jù)兩條單鏈DNA或DNA與RNA中互補(bǔ)堿基序列能專一配正確原理，在一定條件 下，利用已標(biāo)記的目的基因的DNA或

6、RNA片段作為探針，探測轉(zhuǎn)化子受體細(xì)胞中 是否有DNA或RNA片段與目的基因探針發(fā)生同源性雜交，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臋z測，從而 確定目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞基因組的方法。Southern 雜交: (1)定義：DNA與DNA之間的雜交。利用硝酸纖維素膜或尼龍膜具有吸附DNA 的功能，先作DNA片段的凝膠電泳，并將凝膠電泳中的DNA區(qū)帶吸附到膜上，然 后直接在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記核酸探針與被測樣品之間的雜交，再經(jīng)過放射自 顯影對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測。流程(6): DNA電泳 轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜時要凝膠底面朝上，上蓋硝酸纖維素 膜) 預(yù)雜交 雜交 洗膜 放射自顯影檢測Northern雜交：將RNA樣品經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行

7、分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸 纖維素濾膜上，用同位素或生物素標(biāo)記的DNA或RNA特異探針針對固定于膜上的 mRNA進(jìn)行雜交，洗脫除去非特異性雜交信號，對雜交信號進(jìn)行分析，以確定目 的基因的表示組織。DNA與RNA的雜交。Western雜交原理：是指經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn) 移到固相載體(硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)， 且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。Western雜交操作流程：聚丙烯酰胺凝膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色，檢查蛋白質(zhì)分離的效果電轉(zhuǎn)膜：90伏，2小時4度 纖維素膜用10%小牛血清BSA封閉30分鐘，以封閉未吸附蛋白質(zhì)的部位纖維素膜與第一抗體溫

8、育，沖洗后再封閉與酶標(biāo)第二抗體溫育加入酶促底物顯色 胚胎原位雜交技術(shù)(原位雜交)： 是利用堿基互補(bǔ)配正確原理，用帶有 標(biāo)記的目的DNA或RNA片段作為核酸探針，與胚胎或組織內(nèi)的mRNA進(jìn)行雜交，然 后經(jīng)過放射自顯影、熒光顯微鏡觀察或酶促底物顯色的方法予以顯示，確定目 的基因的mRNA的存在與定位情況?；蛐酒?將cDNA或RNA以點的形式結(jié)合在尼龍膜，玻片或塑料片上，形成 距陣排列，與同位素或熒光標(biāo)記的探針雜交,經(jīng)過放射自顯影或熒光掃描儀檢測 雜交信號。雙向凝膠電泳技術(shù)：是應(yīng)用于高分辨率地分離細(xì)胞、組織或其它生物樣品 中蛋白質(zhì)混合物的技術(shù)。其基本原理是首先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點在pH梯度膠中 等

9、電聚焦，然后按照它們的分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDS第二次電泳分離，從而 最大限度地分離蛋白質(zhì)的方法。第一向等電聚焦(IEF)電泳：等電聚焦區(qū)分帶不同電荷的分子第二向SDSPAGE:分離不同分子量蛋白質(zhì)基因敲除：是指利用外源的已突變的基因經(jīng)過同源重組的方法替換掉內(nèi)源的正常同源基因，從而使內(nèi)源基因失活而表現(xiàn)突變體的性狀的技術(shù)或方法。RNA干擾(RNAi): 是指經(jīng)過反義RNA與正義RNA形成的雙鏈RNA特異性 地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表示的現(xiàn)象，它經(jīng)過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有同源 序列的雙鏈RNA( dsRNA),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表 示的目的。凝膠遷移率阻滯EMSA:是將待研

10、究的DNA序列和待研究的蛋白質(zhì)置于非變性的聚丙烯酰胺凝膠中電泳, 其中DNA序列分為兩組，一組用32P同位素標(biāo)記，稱為探針或熱探針；另一組不 加標(biāo)記，稱為冷探針。電泳時，DNA序列產(chǎn)生一條帶(自由探針帶)。而結(jié)合了 蛋白質(zhì)的DNA因為跑的慢，會在DNA探針帶的后面產(chǎn)生另一條移動慢的帶(DNA 在凝膠中的遷移率受到阻滯)。由于DNA序列帶有同位素標(biāo)記，可經(jīng)過放射自顯 影顯示這兩條帶的位置。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)：是體內(nèi)研究DNA序列與蛋白質(zhì)相互作用的方法?；驹恚夯驹硎窃诨罴?xì)胞狀態(tài)下固定體內(nèi)蛋白質(zhì)一DNA相互作用的 復(fù)合物，然后將染色質(zhì)DNA提取出來并將其用超聲波隨機(jī)切斷為一定長度的染 色質(zhì)小

11、片段，然后經(jīng)過免疫學(xué)方法用某種蛋白質(zhì)特異的抗體沉淀此復(fù)合體，特 異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，經(jīng)過對目的DNA片斷的分離、純化與檢 測，獲得DNA序列信息，從而確定與特定蛋白質(zhì)相互作用的DNA序列。P155 圖酵母雙雜交技術(shù)的原理：P156 圖利用酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的基本特征，只有同時存在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域BD和轉(zhuǎn)錄激 活結(jié)構(gòu)域AD才能保證GAL4的轉(zhuǎn)錄激活活性。因此，單獨誘餌蛋白及BD與UAS 結(jié)合，不能使報告基因表示；單獨使待測蛋白及AD與UAS結(jié)合，也不能使報告 基因表示。只有待測蛋白與誘餌蛋白相互作用，才能使BD與UAS結(jié)合促使報告 基因表示。免疫共沉淀COIP:P158 圖（1）是以抗體和抗原之間的專一性反應(yīng)為基礎(chǔ)研究兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生 理活性狀態(tài)下相互作用的有效方法。（2）原理：完整細(xì)胞內(nèi)存在許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用，如果用蛋白質(zhì) A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么在體內(nèi)與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能被沉淀下來。 經(jīng)過SDS膠時，用B蛋白的特異標(biāo)記抗體檢測，應(yīng)該能夠檢測到A和B兩 種蛋白結(jié)合的帶。同理，如果用B蛋白的抗體去免疫沉淀B蛋白質(zhì)，那么與B 蛋白結(jié)合的