生物素親和素系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)

1、關(guān)于生物素親和素系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)第一張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一) 生物素及活化生物素二) 親和素及鏈霉親和素三) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)第二張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一）生物素及活化生物素(一)生物素1 概念： 生物素(biotin)是動(dòng)、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長(zhǎng)因子，又名輔酶R或維生素H。2.分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31第三張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.結(jié)構(gòu)： （CH2）4COOH 結(jié)合親和素結(jié)合蛋白質(zhì)咪唑酮環(huán)噻吩環(huán)第四張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月whywhywhy為什么要

2、對(duì)生物素進(jìn)行活化？為什么要對(duì)生物素進(jìn)行活化？第五張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月我是生物素我可以是抗體，也可以是酶第六張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月我是親和素，我來(lái)了第七張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Broken Heart第八張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月我是親和素，我來(lái)了第九張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1）生物素分子較小，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，由于大分子蛋白質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，可影響生物素與親和素間的結(jié)合； 2）生物素只能依靠肽鍵與蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合。 因此，活化生物素可克服以上缺點(diǎn)，既減少空間位阻效應(yīng)，又可擴(kuò)大其結(jié)合的對(duì)象。(二)活化生物素第十

3、張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生物素與蛋白質(zhì)的結(jié)合第十一張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）。 2.標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。 3.標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基：3-（N-馬來(lái)酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。 4.標(biāo)記核酸：光生物素、生物素脫氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。 第十二張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）。 抗體中性和偏堿性蛋白的標(biāo)記第十三張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2

4、.標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ） 用于偏酸性糖蛋白的生物素標(biāo)記第十四張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記對(duì)象： 大分子活性物質(zhì)：如抗原、抗體。標(biāo)記后不影響免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。會(huì)降低ALP的活性。(三)生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第十五張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月活化生物素可與不同的大分子物質(zhì)結(jié)合，應(yīng)根據(jù)可標(biāo)記基團(tuán)的種類(lèi)及特性，選擇相應(yīng)的活化生物素； 抗體：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素第十六張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一個(gè)蛋白質(zhì)分子可聯(lián)結(jié)多個(gè)生物素分子，即生物素化大分子具有多價(jià)性，它是BAS多級(jí)放大

5、作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但每個(gè)蛋白質(zhì)上標(biāo)記的生物素分子數(shù)量應(yīng)控制在一定范圍。 每個(gè)抗原標(biāo)記1-3個(gè)生物素分子為宜； 每個(gè)抗體標(biāo)記3-5個(gè)生物素分子為宜； 生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果較好。第十七張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一) 生物素及活化生物素二) 親和素及鏈霉親和素三) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)第十八張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二）親和素和鏈霉親和素(一) 親和素(avidin，A) 1.概念：是動(dòng)物微生物中提取的一種含10%碳 水化物的堿性糖蛋白。 2.分子量：68 0003.結(jié)構(gòu)：4個(gè)相同亞基組成的四聚體糖蛋白，富含色氨酸，

6、它是與生物素結(jié)合的基團(tuán)。第十九張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A4.特性：每個(gè)亞基都可結(jié)合1個(gè)生物素分子，即1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子。5.親和常數(shù)：1015/mol6.缺點(diǎn)：由于是堿性蛋白（PI=10），且含糖基，與聚苯乙烯的非特異性吸附較高，會(huì)導(dǎo)致本底增大，降低檢測(cè)靈敏度。第二十張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二）親和素和鏈霉親和素(二)鏈霉親和素(streptavidin，SA) ：1.概念：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質(zhì)。2.分子量：65 0003.結(jié)構(gòu)：由4個(gè)相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸含量較大 。第二十一張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4

7、.特性：1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子。5.親和常數(shù)：1018/mol6.優(yōu)點(diǎn)：為弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此與聚苯乙稀的非特異性吸附遠(yuǎn)低于親和素，因此應(yīng)用廣泛。SA第二十二張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記對(duì)象： 大分子物質(zhì)：如酶、抗原和抗體。 小分子物質(zhì)：膠體金、FITC和化學(xué)發(fā)光物等。二）親和素和鏈霉親和素(三 ) 親和素的標(biāo)記 第二十三張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一) 生物素及活化生物素二) 親和素及鏈霉親和素三) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)第二十四張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三）生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)

8、1.特異性強(qiáng)： 親和素和生物素間的高親和力。2.靈敏度高： 每個(gè)親和素分子可與四個(gè)生物素結(jié)合； 生物素化大分子具多價(jià)性。3.快速、穩(wěn)定：4.應(yīng)用廣泛： 可與酶、熒光素、膠體金等多類(lèi)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合；第二十五張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 可有Ag與Ab反應(yīng)的各種免疫方法：夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等，在此基礎(chǔ)上引入A-B系統(tǒng)。BAB法：BA法：ABC法：二、 BAS的基本類(lèi)型及原理第二十六張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月BAB法： AbB A AbB-A B AbB-A-B 特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-E；AbB和A-B的兩次放大效應(yīng)，可提高靈敏度。 第二十七張，PPT共四十

9、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月+A+A+BAB法在夾心ELISA中的應(yīng)用第二十八張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月BA法： AbB A AbB-A 特點(diǎn)：省略加標(biāo)記生物素步驟，操作較BAB法簡(jiǎn)便；AbB的放大效應(yīng)，該法有相當(dāng)高的靈敏度。第二十九張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月+A-EBA法在間接ELISA中的應(yīng)用第三十張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ABC法： A+B A- B -ABC Ag+AbB Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特點(diǎn)：是在BAB法基礎(chǔ)上的改良，將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC；操作比BAB法簡(jiǎn)便，但仍然保持較高的靈敏度。第三十

10、一張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月+ABCB-E + A ABCABC法在夾心ELISA中的應(yīng)用第三十二張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、BAS在酶免疫技術(shù)中的應(yīng)用2、BAS在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用3、BAS在放射免疫技術(shù)中的應(yīng)用4、 BAS在分子生物學(xué)中的應(yīng)用三、 生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用第三十三張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫-PCR 免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的新方法，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色。 PCR具有很強(qiáng)的放大能力，其可以定量地檢測(cè)DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過(guò)連接分子與DNA

11、結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，由此定量檢測(cè)抗原使敏感性高于ELISA和RIA。 第三十四張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月免疫-PCR一、主要程序1. 抗原+生物素化抗體抗原-生物素化抗體復(fù)合物； 2. 加親合素抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物； 3. 加生物素化DNA抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA； 4. PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。 第三十五張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5533變性、退火變性、退火第三十六張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)具有高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍第三十七張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、免疫PCR的發(fā)展 免疫PCR技術(shù)目前尚處于研究階段，應(yīng)用的還不多； 實(shí)驗(yàn)表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產(chǎn)生的背景信號(hào)很弱，可以檢測(cè)到幾百個(gè)分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測(cè)到一個(gè)分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測(cè)一些含量特別少的抗原分子。 第三十八張，PPT共四十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在報(bào)