鄧云峰-結(jié)核病核酸檢測(cè)技術(shù)

1、2018-5-14全球結(jié)核病疫情概覽估算發(fā)病率 估算發(fā)病人 發(fā)病數(shù)占全數(shù)球比例結(jié)核病核酸檢測(cè)技術(shù)全球142/10萬195/10萬64/10萬1040萬905萬高負(fù)擔(dān)國(guó)家中國(guó)87.1%89.5萬8.6%（全球3位）耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病鄧云峰結(jié)核病患者中比例估算發(fā)病 發(fā)病數(shù)占全人數(shù)球比例新患者3.9%復(fù)治患者21%全球600 000520 00073 000-山東省胸科醫(yī)院高負(fù)擔(dān)國(guó)家中國(guó)4.3%7.1%22%24%90%山東省呼吸病與結(jié)核病防治研究中心12%（全球2位）2016年報(bào)告發(fā)病率（數(shù)）不同職業(yè)報(bào)告肺結(jié)核患者構(gòu)成發(fā)病數(shù)居前10位省份人口數(shù)占全國(guó)的47.7%發(fā)病數(shù)占全國(guó)57.8%2016

2、年： 農(nóng)牧漁民比例最高，占65.5% 其次為家務(wù)及待業(yè)者，占12.1% 再次為離退休，占4.5% 學(xué)生所占比例為3.8%結(jié)核診斷的常見技術(shù)抗酸桿菌檢查傳統(tǒng)技術(shù)現(xiàn)代技術(shù)n涂片 直涂厚涂離心濃縮影像學(xué)涂片鏡檢培養(yǎng)皮膚菌素試驗(yàn)IGRA分子診斷n染色 萋尼氏熒光法n鏡檢 雙目熒光LED 自動(dòng)閱片可診斷活動(dòng)期結(jié)核無法區(qū)分活動(dòng)期結(jié)核與潛伏期結(jié)核 感染12018-5-14分枝桿菌分離培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)當(dāng)前臨床診治的難點(diǎn)n固體培養(yǎng)基依據(jù)抗酸染色為基礎(chǔ)的結(jié)核初篩的不可靠性nnn 改良羅氏培養(yǎng)基 瓊脂培養(yǎng)基（7H10,7H11）n液體培養(yǎng)基敏感性為50%結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌不能區(qū)分（ NTM可能占到40%） Midd

3、lebrook 7H9以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的結(jié)核確診和藥敏對(duì)治療的影響n自動(dòng)化培養(yǎng)設(shè)備 BACTEC MGIT 960 BacT/ALERT 3D2個(gè)月才獲得藥敏結(jié)果，導(dǎo)致患者脫落2個(gè)月后調(diào)整治療方案，導(dǎo)致耐藥患者的漏診和傳播 Versa TREK/ESP II無法更早確診耐藥結(jié)核患者“十三五”結(jié)核病規(guī)劃指標(biāo)我國(guó)結(jié)核傳染源的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)狀“十三五”規(guī)劃指標(biāo)目標(biāo)值報(bào)告肺結(jié)核患者和疑似肺結(jié)核患者的總體到 95%以上位率病原學(xué)檢查陽性肺結(jié)核患者的密切接觸者篩 95%查率達(dá)到肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率50%以上95%以上耐多藥肺結(jié)核高危人群耐藥篩查率肺結(jié)核患者成功治療率90%以上2016年全球30個(gè)高負(fù)擔(dān)國(guó)家細(xì)菌學(xué)確診

4、病例所占比例（ %）高負(fù)擔(dān)國(guó)家的耐藥結(jié)核發(fā)現(xiàn)最新的兩個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)我國(guó)當(dāng)前耐藥結(jié)核防控的問題：nn結(jié)核病分類WS196-2017不充分的耐藥病人發(fā)現(xiàn) ，不充足的耐藥病人治療肺結(jié)核診斷WS288-2017 2018年5月1日實(shí)施 分子檢測(cè)成為確診依據(jù)5.56%納入治療22018-5-14十三五結(jié)核病防治規(guī)劃環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增設(shè)備要求較低1.加強(qiáng)技術(shù)培訓(xùn)和質(zhì)量控制操作復(fù)雜，人工判讀結(jié)果技術(shù)培訓(xùn)和技術(shù)指導(dǎo)痰涂片室間質(zhì)評(píng)藥敏熟練度測(cè)試分子診斷及耐藥基因檢測(cè)的室間質(zhì)評(píng)2.新診斷技術(shù)推廣應(yīng)用新診斷工具的物價(jià)審批逐步納入基層醫(yī)療保險(xiǎn)范圍3. 逐步推廣新診斷技術(shù)地市級(jí)縣區(qū)級(jí)l結(jié)核分枝桿菌及是否對(duì)利福平和異煙肼耐藥l基

5、因芯片l檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌l環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增l多色巢氏熒光PCR法l交叉引物法l溶解曲線l線性探針lRNA等溫?cái)U(kuò)增法恒溫?cái)U(kuò)增 試紙條法實(shí)時(shí)熒光RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)RNA檢測(cè)技術(shù)，高靈敏度，可區(qū)分活菌和死菌，適用于療操作步驟：效監(jiān)測(cè)1. 將痰液液化、離心、滅活，制備成核酸擴(kuò)增模板液2. 取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒溫裝置中擴(kuò)增需配備超聲波儀，且仍需要實(shí)時(shí)熒光 PCR儀檢測(cè)無耐藥檢測(cè)WHO未評(píng)估或推薦3. 使用水浴鍋或金屬浴；63擴(kuò)增1小時(shí)；4. 將完成擴(kuò)增的PCR管放入一次性防污染擴(kuò)增物試紙條檢測(cè)裝置中檢測(cè) , 15分鐘目測(cè)定性結(jié)果手工操作步驟相對(duì)較少無需昂貴的儀器無耐藥檢測(cè)手工

6、操作相對(duì)較少WHO未評(píng)估或推薦半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR（Xpert）最直觀的診斷報(bào)告PCR的目標(biāo)是rpoB基因的81 bp區(qū)域：5個(gè)探針結(jié)合到野生型，而不是突變體目標(biāo)系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成結(jié)果解釋痰標(biāo)本與處理液1：2混合分子信標(biāo)樣本及測(cè)試信息DNA反應(yīng)和半巢式實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)標(biāo)本自動(dòng)清洗過濾超聲裂解DNA提純PCR試劑混合靶序列雜交體吸取2ml處理樣品到反應(yīng)盒打印檢測(cè)報(bào)告實(shí)時(shí) PCR擴(kuò)增曲線將反應(yīng)盒放入檢測(cè)模塊（手工操作完成）每個(gè)探針用不同的熒光染料標(biāo)記，允許同時(shí)檢測(cè)。獲得檢測(cè)結(jié)果時(shí)間：1小時(shí)45分鐘|32018-5-14WHO關(guān)于Xpert MTB/RIF的推薦和指南2014 WHO關(guān)于結(jié)核診斷

7、的標(biāo)準(zhǔn)政操專策作家肺結(jié)核n性性共文文識(shí)所有患者，包括兒童，當(dāng)疑似肺結(jié)核并可咳痰時(shí)，應(yīng)送2份痰做涂片鏡檢 或 1份痰做件件Xpert MTB/RIF檢測(cè)；當(dāng)患者具有耐藥結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)，或者合并HIV感染，或者病情嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)使用XpertMTB/RIF做初始診斷；對(duì)于涂陰疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)當(dāng)使用Xpert MTB/RIF或培養(yǎng)進(jìn)行診斷基于血標(biāo)本的血清學(xué)檢測(cè)或 -干擾素釋放試驗(yàn)不能用于活動(dòng)性結(jié)核的診斷結(jié)結(jié)結(jié)核核核報(bào)關(guān)實(shí)告懷驗(yàn)新n肺外結(jié)核所有患者，包括兒童，懷疑有肺外結(jié)核 時(shí)，應(yīng)當(dāng)采集相應(yīng)的樣本進(jìn)行微生物學(xué)和組織國(guó)室框際安架標(biāo)全學(xué)檢查；優(yōu)先推薦使用Xpert MTB/RIF做初始診斷準(zhǔn)手冊(cè)n對(duì)于耐多藥結(jié)核

8、的高危人群，應(yīng)使用 Xpert MTB/RIF進(jìn)行初始診斷疾病分類Xpert作為診斷指標(biāo)說明疾病分類Xpert作為診斷指標(biāo)說明肺外結(jié) 泌尿系統(tǒng)結(jié)核核尿液Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法具有敏感性和特異性高以及快速等優(yōu)點(diǎn)，是診斷泌尿系統(tǒng)結(jié)核的重要新方法；肺結(jié)核 原發(fā)性肺結(jié)核病Xpert MTB/RIF 陽性，可以確定診斷；Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法具有重要價(jià)值；血行播散性肺結(jié)核生殖系統(tǒng)結(jié)核進(jìn)行Xpert MTB/RIF 檢測(cè)對(duì)男性生殖系統(tǒng)結(jié)核的診斷具有重要價(jià)值。繼發(fā)性肺結(jié)核診斷繼發(fā)性肺結(jié)核的重要手段，此外， Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法還可檢測(cè)利福平耐藥基因 rpoB 的突變用于

9、診斷利福平耐藥結(jié)核?。黄渌课唤Y(jié)核特殊人 老年結(jié)核病群結(jié)核氣管、支氣管結(jié)核痰抗酸桿菌陽性或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或 Xpert MTB/RIF 陽性；兒童結(jié)核病WHO 推薦的Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法在兒童結(jié)核病中的診斷具有重要價(jià)值；肺外結(jié) 結(jié)核性胸膜炎核是診斷結(jié)核性胸膜炎的重要方法；妊娠結(jié)核病Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法在診斷妊娠結(jié)核病也具有重要價(jià)值。結(jié)核性腦膜炎結(jié)核性心包炎結(jié)核性腹膜炎腸結(jié)核可以明顯提高結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率；心包液Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法可明顯提高陽性檢出率腹腔積液Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法具有重要價(jià)值結(jié)核病 結(jié)核病與糖尿病和其他疾病結(jié)核病與矽

10、肺是診斷硅沉著病結(jié)核的重要手段；在HIV/TB 患者具有重要的診斷價(jià)值；Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性有確診意義；結(jié)核病與艾滋病淋巴結(jié)結(jié)核淋巴結(jié)穿刺液或膿液行Xpert MTB/RIF 檢查為淋巴結(jié)結(jié)核一種新的重要診斷手段，具有敏感性高、特異性強(qiáng)和快速等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用；結(jié)核病與其他免疫缺陷病耐藥耐藥結(jié)核病在懷疑患者有原發(fā)耐藥的重癥肺結(jié)核時(shí)可考慮應(yīng)用，當(dāng)Xpert試劑盒臨床驗(yàn)證山東胸科Xpert試劑盒臨床驗(yàn)證山東胸科XpertMTB檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷的一致性分析 本次臨床試驗(yàn)共入選523例樣本，其中4例樣本由于數(shù)據(jù)不全被剔除，最終納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的樣本數(shù)共519例。臨床診斷Xpert M

11、TB合計(jì)檢測(cè)結(jié)果肺結(jié)核非肺結(jié)核陽性陰性合計(jì)2051573622207293500 519例有效樣本中，其中臨床診斷為肺結(jié)核的患者樣本362例， 臨床診斷為非肺結(jié)核的患者樣本138例，臨床診斷不明確的患者樣本19例。136138陽性符合率56.63，95 CI 51.35（，61.80 .）陰性符合率98.55，95 CI（94.86，99.82）.42018-5-14Xpert試劑盒臨床驗(yàn)證山東胸科Xpert試劑盒臨床驗(yàn)證山東胸科nXpertMTB和培養(yǎng)+鑒定結(jié)果的一致性分析XpertMTB與抗酸染色鏡檢結(jié)果的一致性培養(yǎng)+鑒定結(jié)果Xpert MTB檢測(cè)結(jié)果合計(jì)Xpert MTB涂片結(jié)果合計(jì)陽性

12、陰性檢測(cè)結(jié)果陽性陰性62陽性陰性合計(jì)1861421207312519陽性陰性合計(jì)1434205157298319153215200147362)陽性符和率93.00，95CI（88.53，96.12）.陰性符和率93.42，95CI（90.11，95.88）.總符和率= 93.26，95CI（90.75，95.26）.涂片陽性肺結(jié)核: Xpert 檢出率=97.28， 95CI（93.18，99.25）涂片陰性肺結(jié)核: Xpert 檢出率=28.84， 95CI（22.88，35.39）Xpert試劑盒臨床驗(yàn)證山東胸科Xpert試劑盒臨床驗(yàn)證山東胸科nXpertMTB與達(dá)安MTB檢測(cè)的一致性分

13、析Xpert利福平耐藥與藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致性達(dá)安檢測(cè)結(jié)果Xpert rpoB 基因突變Xpert MTB 檢測(cè)結(jié)果合計(jì)利福平藥敏試驗(yàn)合計(jì)檢測(cè)結(jié)果耐藥410敏感陽性陰性突變不確定無突變合計(jì)5461陽性192152071陰性合計(jì)9303318312519213714213918543201陽性符合率95.52，95 CI（91.67，97.93).陰性符合率95.28，95CI（92.34，97.34）.總符合率95.38，95CI（93.20，97.02）.陽性符合率 95.35，95CI（84.19，99.43）.陰性符和率 96.48，95%CI（91.97，98.85）.總符合率 96.2

14、2，95CI（92.36，98.47）.Xpert試劑盒的臨床應(yīng)用山東胸科Xpert試劑盒的臨床應(yīng)用山東胸科GeneXpert MTB/RIF分枝桿菌培養(yǎng)陽性 NTM涂片熒光鏡檢臨床診斷結(jié)核病肺結(jié)核 痰(n = 192)GeneXpert分枝桿菌培養(yǎng)熒光涂片鏡檢三種方法聯(lián)合標(biāo)本類型 不確定陰性98陽性陰性0污染陰性0陽性痰(n=229)10103300112115167.7% (130/192)12.3% (10/81)65.1% (125/192)14.8% (12/81)61.5% (118/192)1.2% (1/81)69.8% (134/192)23.5%(19/81)8264121

15、8900086159010腦脊液(n = 81)13010腦脊液(n=101)91836胸水(n = 95)組織 (n = 18)尿(n = 9)16.8% (16/95)61.1% (11/18)22.2% (2/9)34.7% (33/95)5.6% (1/18)3.2% (3/95)33.3% (6/18)11.1% (1/9)0% (0/7)38.9% (37/95)61.1% (11/18)33.3% (3/9)40胸水(n=124)10811874211200001081303161122.2% (2/9)組織樣本(n=22)111001000011506腹水(n = 7)所有肺外

16、樣本(n = 210)14.3% (1/7)28.6% (2/7)28.6% (2/7)尿(n=21)19.0% (40/210)23.8% (50/210)5.2% (11/210)34.3% (72/210)198190020000190000003318210201腹水(n=9)7180Total (n = 402)42.3% (170/402)43.5% (175/402)32.1% (129/402)51.2% (206/402)0110合計(jì)(n=506 )10001Xpert MTB/RIF試驗(yàn)診斷肺結(jié)核病的有具有較好的敏感度，肺外結(jié)核敏感度低，無論是肺結(jié)核還是肺外結(jié)核，三種方法聯(lián)

17、合使用敏感度高于單一使用一種診斷技術(shù)。與其他兩種方法相比 XpertMTB/RIF試驗(yàn)更適合于組織樣本檢測(cè)。33528926341413214614124170Xpert試驗(yàn)與非結(jié)核分枝桿菌無交叉反應(yīng)，可以通過 Xpert MTB/RIF試驗(yàn)來排除非結(jié)核分枝桿菌感染。52018-5-14熔解曲線技術(shù)MeltPro TB操作界面核酸提取擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果原理：一定環(huán)境下，DNA雙鏈在其長(zhǎng)度和序列一定時(shí)， Tm值也一定，發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，Tm值下降，下降幅度與發(fā)生錯(cuò)配的堿基數(shù)目、類型和位置有關(guān)2-3小時(shí)獲得結(jié)果，目前通過CFDA的有利福平和異煙肼耐藥等五套試劑盒WHO未評(píng)估或推薦配套設(shè)備：核酸提取儀、PCR儀

18、等MeltPro 耐藥結(jié)核檢測(cè): 覆蓋位點(diǎn)MeltPro TB 系統(tǒng): 注冊(cè)狀態(tài)CFDA注冊(cè)證乙胺丁醇利福平異煙肼氟喹諾酮鏈霉素CFDA注冊(cè)中注射類二線藥+ 吡嗪酰胺， NTM, NAT-2多中心驗(yàn)證（2013-2015年）MeltPro TB利福平耐藥檢測(cè)性能蓋茨基金會(huì)結(jié)核病防治項(xiàng)目中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室廣州市胸科醫(yī)院山東省胸科醫(yī)院驗(yàn)證對(duì)象：GeneXpert和Genotype MTBDR的靈敏度分別為87.10%和88.3%，低于本次研究中MeltPro TB RIF的94.2%。廈門致善MeltPro TB 利福平、異煙肼、氟喹諾酮和注射類二線藥耐藥突變檢測(cè)試劑Sci.

19、 Rep. 6, 25330; doi: 10.1038/srep25330 (2016)62018-5-14MeltPro TB異煙肼耐藥檢測(cè)性MeltPro TB耐多藥結(jié)核檢測(cè)性能MeltPro TB 檢測(cè)耐多藥結(jié)核的靈敏度和特異性分別為 86.7%和97.7%。Sci. Rep. 6, 25330; doi: 10.1038/srep25330 (2016)由于覆蓋了ahpC啟動(dòng)子區(qū)，MeltPro TB INH的靈敏度（84.9%）高于Genechip 和 Genotype MTBDR的靈敏度（80.34%和80.2%）。Sci. Rep. 6, 25330; doi: 10.1038

20、/srep25330 (2016)各類分子診斷技術(shù)比對(duì)MeltPro TB氟喹諾酮耐藥檢測(cè)性能（液體培養(yǎng)/DST為金標(biāo)準(zhǔn)）線性探針基因芯片恒溫?cái)U(kuò)增（試紙條法）RNA恒溫?cái)U(kuò)增LAMP熔解曲線X p e r tMTB/RIF結(jié)核及耐藥結(jié)核初始診斷是否WHO推薦儀器通量耐藥結(jié)核診斷否否否否否12（手工）6或12（選用雜交儀可同時(shí)做12個(gè)樣品）單個(gè)2小時(shí)通量取決于擴(kuò)增儀2小時(shí)純手工操作20或48（自動(dòng)）961-80出報(bào)告時(shí)間6小時(shí)6小時(shí)2小時(shí)2-3小時(shí)2小時(shí)試劑儲(chǔ)存條件部分試劑需冷凍部分試劑需冷凍 部分試劑需冷凍 部分試劑需冷凍室溫儲(chǔ)存部分試劑需冷凍室溫儲(chǔ)存涂陽培陽樣本MTB靈敏度無無無無84.1%5

21、9.8%5584.6%61.9%6698.2%55.6%7780%81%8898%3涂陰培陽樣本MTB靈敏度68%3-88.8%2RIF：93.1%-98%1INH：85%3RIF：91.8%-94.6%4INH：70.2%-78.1%4RIF：90.9%-96.4%9INH：81.0%-88.1%9FQ：78.2%-87.5%9耐藥靈敏度無無無RIF 95%3MeltPro TB 檢測(cè)氟喹諾酮耐藥的靈敏度和特異性分別為 83.3%和98.1%。Sci. Rep. 6, 25330; doi: 10.1038/srep25330 (2016)1.2.3.4.5.6.7.8.9.陳琛等 . 分子

22、線性探針測(cè)定法杖結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展Xichao Ou et al. feasibility study of the Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Disease. 2015 (31): 41.WHO. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children Policy Update.Guo, et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using biochip system. International Journal of Infectious Disease. 2009 (13): 914.Xichao Ou et al. multicenter study of Cross-