B組柯薩奇病毒對(duì)心肌細(xì)胞感染模式的研究

1、B組柯薩奇病毒對(duì)心肌細(xì)胞感染形式的研究【摘要】目的觀察B組柯薩奇病毒(xsakievirusB，VB)在原代心肌細(xì)胞中的感染特點(diǎn)，從而研究VB對(duì)心肌細(xì)胞的致病機(jī)制。方法原代培養(yǎng)Balb/乳鼠心肌細(xì)胞，并獲得純化的心肌細(xì)胞。使用B組柯薩奇病毒嗜心肌毒株3型(VB3)攻擊原代心肌細(xì)胞，觀察病毒感染心肌細(xì)胞后心肌細(xì)胞的細(xì)胞病變、超微構(gòu)造和心肌酶的變化。結(jié)果成功原代培養(yǎng)了Balb/乳鼠心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞在病毒感染后，細(xì)胞病變(PE)不明顯，與在HeLa等細(xì)胞中的典型PE不同。心肌細(xì)胞在VB3感染后保持細(xì)胞形態(tài)和博動(dòng)超過(guò)2周時(shí)間。電鏡顯示心肌細(xì)胞構(gòu)造正常，細(xì)胞器數(shù)量增加，在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)晶格樣病毒顆

2、粒排列。培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中心肌酶升高。結(jié)論VB在原代心肌細(xì)胞中表現(xiàn)為持續(xù)感染，VB在心肌細(xì)胞中的致病機(jī)制不同于HeLa細(xì)胞。【關(guān)鍵詞】心肌細(xì)胞;B組柯薩奇病毒;Balb/乳鼠;原代細(xì)胞培養(yǎng)Abstrat:bjetiveTinvestigatetheharateristisfxsakievirusB(VB)npriarilyulturedyardialellsandtexplrethepathgenesisfardiyytes.ethdsardiyytesfrBalb/suklinguseereulturedinvitr,andpurifiedyardialellserebtained.Theu

3、lturedyardialellsereattakedithVB3,ayardialtrpixsakievirusBstrain.Theytpathieffet(PE)andultrastrutureftheVB3-infetedyardialellserebserved.Thevariatinsfyardialenzyesinthesupernantftheultureediueredeterined.ResultsTheardiyytesfrnenateBalb/ieeresuessfullyultured.NapparentPEuldbebservedintheulturedyardia

4、lellsfllingtheVB3attak,hihasdifferentfrthetypialPEintheinfetinsfHeLaells.Theardiyytesretainedintatrphlgyandpulsatinfrverteeksasftheinfetin.Theeletrniirspyshedthattheyardialellshadnralultrastruture,ithaninreaseinthenuberfrganellesandvisiblerystally-arrangedviralpartilesintheytplas.Thelevelfyardialenz

5、yesinthesupernatantftheinfetedyardialellsashigherthanthatfthentrlgrup.nlusinVBanpersistentlyinfetardiyytes.ThepathgenesisfVBnyardialellsdiffersfrthatinHeLaell.Keyrds:ardiyytes;xsakievirusB;sukingBalb/use;priaryellultureB組柯薩奇病毒(xsakievirusB，VB)是病毒性心肌炎和心肌病的主要病因，其敏感動(dòng)物模型是Balb/乳鼠，假如要離體研究VB對(duì)心肌的致病性，必須原代培養(yǎng)B

6、alb/乳鼠心肌細(xì)胞1。VB感染細(xì)胞通常表現(xiàn)為急性殺細(xì)胞病變，例如，宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞是VB致病機(jī)制研究中最常用的細(xì)胞平臺(tái)，VB感染HeLa細(xì)胞后，在24h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(PE)，細(xì)胞變圓聚集，48h細(xì)胞死亡脫落;理論上，VB感染心肌細(xì)胞也應(yīng)該表現(xiàn)為殺細(xì)胞效應(yīng)。但是，分子流行病學(xué)研究證明，VB可以持續(xù)存在心肌組織中。Quigley等2觀察23例臨床和組織學(xué)表現(xiàn)為心肌炎的患者，其中12例在平均43個(gè)月中開(kāi)展為擴(kuò)張型心肌病(D)，隨后4例死亡，2例心臟移植，1例痊愈，其余仍為D。本課題利用VB1核酸、嗜心肌毒株B組柯薩奇病毒3型(VB3)攻擊原代培養(yǎng)的Balb/乳鼠心肌細(xì)胞，觀察VB在心肌細(xì)

7、胞中的感染特點(diǎn)，從而說(shuō)明VB在心肌細(xì)胞中的感染機(jī)制。1材料和方法1.1材料1.1.1病毒VB3由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。1.1.2質(zhì)粒、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物pNI4質(zhì)粒含VB1DNA全序列3，由日本東京大學(xué)NarushiIizuka教授惠贈(zèng);HeLa細(xì)胞和工程菌株E.liDH5均購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室;Balb/乳鼠(出生4天內(nèi))購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.1.3主要酶類(lèi)及試劑盒質(zhì)粒小量提取試劑盒5001及DNA小量膠回收試劑盒5211購(gòu)自上海華舜生物工程公司。真核轉(zhuǎn)染試劑Tfx-50為Prega公司產(chǎn)品。RNA提取試劑盒TRIzlReagent為Invitrgen公司產(chǎn)品。

8、TherSriptTRT-PR試劑為Invitrgen公司產(chǎn)品。限制性核酸內(nèi)切酶ERV、laI、PstI、堿性磷酸酶IAP及iderangDNAladderarker均為T(mén)akara公司產(chǎn)品。1.1.4主要試劑DE/F12培養(yǎng)基(GIB公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料)，胰蛋白酶(GIB公司)，膠原酶(Siga公司)，兔抗小鼠肌動(dòng)蛋白(atin)抗體(Santaruz公司)，羊抗兔IgG-TRIT(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU，Siga公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.5細(xì)胞培養(yǎng)液DE/F12，pH7.27.4，使用時(shí)參加15%胎牛血清，1%雙抗。消

9、化液為0.2%胰蛋白酶和0.1%膠原酶混合液(11)。BrdU用去離子水配制，參加到15%DE/F12培養(yǎng)液中，終濃度為0.1l/L，可以抑制非心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。1.1.650TAE電泳緩沖液Tris堿242g、冰乙酸57.1l、0.5l/LpH8.0的EDTA100l溶于終體積1000l去離子水中，使用時(shí)150倍稀釋;10加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青、30%甘油混勻后保存于4;10g/L溴化乙錠(EB)溶液：0.2gEB溶于20l去離子水中，混勻后4避光保存，使用時(shí)終濃度為0.5g/L;0.7%和1%瓊脂糖凝膠：0.7%和1%瓊脂糖分別溶于1TAE中。1.2方法1.2.1乳

10、鼠心肌的取材取出生14天內(nèi)的Balb/乳鼠，75%乙醇消毒皮膚，無(wú)菌條件下從胸腔取出心臟，取出的心臟立即放入裝有預(yù)熱37的D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，可見(jiàn)到心臟仍然保持搏動(dòng)。1.2.2乳鼠心肌細(xì)胞的別離和培養(yǎng)取出的心臟在加有37的D-Hanks液的平皿中，洗12次，置于無(wú)血清無(wú)雙抗的DE/F12中，并在其中把心臟剪成體積為13的小塊;事先準(zhǔn)備好2支離心管，第1支參加5l左右15%DE/F12培養(yǎng)液(含血清和雙抗)，第2支空，其中第1支放入4冰箱中備用。將小塊的心肌放入第2支空著的離心管中，并參加1.5l消化液，然后放入到事先準(zhǔn)備好的37的水浴鍋中消化，每次消化11in，棄上清(保持溫度在37)

11、，重復(fù)3次;第4次參加消化液2l，消化20in，每隔5in搖勻，每隔10in吹吸，以加速心肌細(xì)胞的消化，20in后將消化液吸出，放入在4冰箱中的離心管中，重復(fù)3次。將搜集好的心肌細(xì)胞1500r/in離心7in，棄上清，用5l預(yù)熱37的15%DE/F12培養(yǎng)液重懸;在無(wú)菌平皿中用濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除大塊有形成分;將過(guò)濾好的細(xì)胞液搜集到培養(yǎng)瓶中，置于375%2孵箱中培養(yǎng)2h，吸出尚未貼壁的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中，置于375%2孵箱中培養(yǎng)，48h后換液，以后每34天更換培養(yǎng)液1次。定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況并攝影記錄。1.2.3心肌細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下常規(guī)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并

12、可見(jiàn)心肌細(xì)胞的搏動(dòng);超微構(gòu)造觀察：培養(yǎng)的細(xì)胞用消化液消化后，1500r/in離心、搜集心肌細(xì)胞，戊二醛固定，送電鏡中心，透射電鏡觀察并攝片。1.2.4pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前把心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無(wú)雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)，留神肌細(xì)胞90%成層分布后開(kāi)場(chǎng)轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染試劑盒的說(shuō)明進(jìn)展。每天倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的變化，并在轉(zhuǎn)染后的第1、3、6天汲取心肌細(xì)胞的上清液凍存，測(cè)定心肌酶。1.2.5嗜心肌毒株VB3攻擊心肌細(xì)胞培養(yǎng)的心肌細(xì)胞90%成層分布后進(jìn)展病毒接種。方法如下：棄上清，每孔參加稀釋好的病毒100l，375%2孵箱中孵育1h，參加細(xì)胞培養(yǎng)液至1l，375%2孵箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡

13、下觀察心肌細(xì)胞的變化，并在不同的時(shí)間段汲取細(xì)胞上清液，測(cè)定心肌酶譜和提取病毒RNA，最后用消化液消化、1500r/in離心、搜集心肌細(xì)胞，戊二醛固定，超薄切片，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞的超微構(gòu)造。2結(jié)果2.1心肌細(xì)胞形態(tài)觀察倒置顯微鏡下，消化后的心肌細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞數(shù)為4.8109/L，2h后開(kāi)場(chǎng)貼壁生長(zhǎng)，心肌細(xì)胞伸展為圓形、梭形、棒狀、星狀及分叉狀等，12個(gè)呈圓形的胞核，核仁明晰可見(jiàn)，可見(jiàn)心肌細(xì)胞搏動(dòng)，頻率為2030次/in，搏動(dòng)細(xì)胞達(dá)70%，搏動(dòng)頻率有所不同;24h后95%的細(xì)胞均有搏動(dòng)，當(dāng)生長(zhǎng)成片后可見(jiàn)島嶼狀搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率為80150次/in(圖1A);超微構(gòu)造觀察顯示，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肌絲興

14、旺，游離的核糖體、糖原及線粒體豐富，肌節(jié)明顯，粗肌絲與細(xì)肌絲相間排列形成明顯的Z線。相鄰心肌細(xì)胞之間伸出許多突起，由中間連接、橋粒及縫隙連接構(gòu)成閏盤(pán)構(gòu)造。線粒體多分布于核周或排列在肌絲之間，嵴呈板狀，與線粒體長(zhǎng)軸垂直或平行，密集排列。心肌細(xì)胞核為12個(gè)，橢圓形，核仁明晰，染色質(zhì)分布均勻(圖1B)。圖1原代培養(yǎng)Balb/乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察A.倒置顯微鏡下觀察(100);B.心肌細(xì)胞超微構(gòu)造觀察(20000)2.2心肌細(xì)胞成活率的測(cè)定取細(xì)胞懸液，稀釋到109/L，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，未著色的為活細(xì)胞,呈藍(lán)色的為死細(xì)胞,顯微鏡下觀察并計(jì)算心肌細(xì)胞的成活率，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，11個(gè)染藍(lán)色，成活率為

15、94.5%。2.3pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后倒置顯微鏡觀察結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前的心肌細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見(jiàn)：心肌細(xì)胞伸展為圓形、梭形、棒狀、星狀及分叉狀等;胞核多為1個(gè)，間或多個(gè)，核呈圓形，核仁明晰;可見(jiàn)到自發(fā)性搏動(dòng)，但節(jié)律不一，慢的1in僅數(shù)次，快的可達(dá)120次/in以上;細(xì)胞間形成細(xì)胞簇，可出現(xiàn)同簇細(xì)胞的同步搏動(dòng)(圖2A)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第3天，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌細(xì)胞主要為梭形和分叉狀;胞核為12個(gè)，核呈圓形，但是核仁不明晰;仍然可以見(jiàn)到自發(fā)性搏動(dòng)，但是節(jié)律不齊;可見(jiàn)到心肌細(xì)胞呈空泡樣改變，很難看見(jiàn)成簇的心肌細(xì)胞(圖2B)。圖2pNI4轉(zhuǎn)染前后的心肌細(xì)胞形態(tài)比擬(400)A.轉(zhuǎn)染前;B.轉(zhuǎn)染后2

16、.4VB3攻擊后心肌細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果VB3病毒攻擊后3天左右，倒置顯微鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞破裂崩解，細(xì)胞核固縮，飄浮在培養(yǎng)液中。心肌細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(PE)，仍然搏動(dòng)但是較慢、不規(guī)那么，心肌細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)(圖3);超微構(gòu)造觀察可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈矩形，核位于質(zhì)膜下，核周細(xì)胞器豐富，核膜增厚，細(xì)胞核形狀可見(jiàn)畸變，核內(nèi)染色質(zhì)明顯固縮，細(xì)胞膜和肌原纖維根本完好，但是線粒體膜局部破裂，線粒體嵴呈絮狀改變或者腫脹而大小不一，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到結(jié)晶狀的病毒顆粒，呈黑色點(diǎn)狀排列(圖4)。圖3VB3感染的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(100)轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.5pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后心肌酶檢測(cè)結(jié)果分別在轉(zhuǎn)染前

17、(1、3天)和轉(zhuǎn)染后(1、3、6天)汲取細(xì)胞上清液，凍存后使用日立7600型生化自動(dòng)分析儀來(lái)測(cè)定心肌細(xì)胞酶。結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，病毒在心肌細(xì)胞中合成復(fù)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞局部破裂崩解，致使心肌酶都有不同程度的升高(表1);經(jīng)過(guò)3天以后，心肌酶開(kāi)場(chǎng)下降，有的降到了非常低的程度，此時(shí)的心肌細(xì)胞仍然存活并可見(jiàn)搏動(dòng)。2.6VB3病毒攻擊后心肌酶檢測(cè)結(jié)果病毒接種后留1孔做空白對(duì)照，比擬加病毒后心肌酶的變化。結(jié)果可見(jiàn)，病毒感染心肌細(xì)胞后，雖然沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，但是在病毒感染的情況下心肌酶的釋放會(huì)升高(表2)。表1pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后心肌酶測(cè)定結(jié)果(2批心肌細(xì)胞測(cè)定后取平均值)表2病毒接種后心肌細(xì)胞酶測(cè)定(

18、2批心肌細(xì)胞測(cè)定后取平均值)2.7RT-PR擴(kuò)增VB3病毒5-UTR的結(jié)果為了證明心肌細(xì)胞中有VB3存在，并且病毒處于持續(xù)感染狀態(tài)，汲取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后和病毒感染后的心肌細(xì)胞的上清液，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PR擴(kuò)增病毒的5-UTR(asterylergradientPR)，結(jié)果如圖5所示，擴(kuò)增到特異性大小的目的片斷，均為750bp。圖5RT-PR擴(kuò)增VB3病毒5-UTR1.VB3陽(yáng)性對(duì)照;2.pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞的上清液;3.VB3感染心肌細(xì)胞后的病毒上清液;4.陰性對(duì)照;.DL2000arker3討論3.1心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)自1960年Harary首次對(duì)istar乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)展培養(yǎng)，并成功維持自發(fā)性

19、搏動(dòng)長(zhǎng)達(dá)40天以來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者開(kāi)展了離體心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、生理、代謝、病理、藥理等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)的方法在前人方法的根底上加以改良，體外別離和培養(yǎng)Balb/乳鼠心肌細(xì)胞，并成功地獲得了很高的成活率和純度!培養(yǎng)24h后存活的心肌細(xì)胞即可貼壁生長(zhǎng)，而破壞嚴(yán)重的心肌細(xì)胞難于貼壁而懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸腫脹、破裂而死，此時(shí)更換培養(yǎng)液可進(jìn)一步進(jìn)步心肌細(xì)胞的存活率;利用atin免疫熒光檢測(cè)，證明我們獲得的Balb/乳鼠原代心肌細(xì)胞純度達(dá)95%;心肌細(xì)胞搏動(dòng)說(shuō)明具有自律性的心肌細(xì)胞活性和狀態(tài)良好。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：最好選擇14天內(nèi)的新生鼠進(jìn)展原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是3天內(nèi)培養(yǎng)更好;嚴(yán)格無(wú)菌操作，翻

20、開(kāi)胸腔后迅速摘取跳動(dòng)的心臟，操作要純熟快捷;利用BrdU對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用，以及差速貼壁等方法，可以極大地純化心肌細(xì)胞;消化過(guò)程是影響心肌細(xì)胞存活率的重要因素，胰蛋白酶可分解組織間質(zhì)的蛋白成分,但對(duì)肌細(xì)胞膜蛋白亦起較強(qiáng)的破壞作用4，故對(duì)其作用時(shí)間和濃度的要求較為嚴(yán)格。而每次實(shí)驗(yàn)都可能有細(xì)微差異，所以應(yīng)結(jié)合肉眼觀察消化情況及時(shí)終止消化，不宜固定準(zhǔn)確的消化時(shí)間。膠原酶可消化細(xì)胞間質(zhì)的膠原纖維以釋放細(xì)胞，作用較緩和，對(duì)細(xì)胞損傷較小;經(jīng)過(guò)屢次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為單一使用胰蛋白酶消化對(duì)細(xì)胞損傷大，結(jié)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時(shí)細(xì)胞沉淀,進(jìn)步心肌細(xì)胞存活率，細(xì)胞貼壁早，搏動(dòng)出現(xiàn)亦早5。第1

21、次消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否那么會(huì)丟棄一些已消化下來(lái)的心肌細(xì)胞。終止消化后的消化產(chǎn)物應(yīng)立即離心，而后用培養(yǎng)液重懸以使受損的細(xì)胞盡早恢復(fù)。消化過(guò)程中反復(fù)吹打使酶與組織充分均勻接觸，使心肌細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)從而減少消化次數(shù)和時(shí)間，進(jìn)步細(xì)胞存活率。吹打不充分細(xì)胞團(tuán)塊占5%以上會(huì)大大降低心肌細(xì)胞的收獲率，并且從團(tuán)塊中爬出來(lái)的成纖維細(xì)胞影響心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和純度6。培養(yǎng)液是維持細(xì)胞生存的根本條件，心肌細(xì)胞在偏酸性環(huán)境中(pH值7.07.2)更利于生長(zhǎng)，培養(yǎng)液儲(chǔ)存后pH值逐漸升高，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。抗生素的藥效濃度與毒效濃度接近，對(duì)細(xì)胞可造成損害，實(shí)驗(yàn)中注意無(wú)菌操作可有效預(yù)防污染，故培養(yǎng)液盡量少加抗生素7。3.2VB

22、感染心肌細(xì)胞的形式VB感染HeLa細(xì)胞后會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(PE)，在VB攻擊24h72h內(nèi)，被感染的HeLa細(xì)胞變圓、聚堆、固縮，最終漂浮在培養(yǎng)液中，腫脹死亡，表現(xiàn)為急性感染形式。但是嗜心肌的VB3攻擊原代心肌細(xì)胞24h之后，那些梭形、分裂旺盛的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出變圓、聚集等細(xì)胞病變，并在48h后死亡脫落，而心肌細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)，并保持博動(dòng)，相比未感染病毒的心肌細(xì)胞，感染VB3的心肌細(xì)胞的搏動(dòng)稍慢且不規(guī)那么，個(gè)別細(xì)胞在病毒感染后保持博動(dòng)長(zhǎng)達(dá)10天以上。透射電鏡觀察可見(jiàn)，被感染的心肌細(xì)胞超微構(gòu)造根本完好，線粒體變化明顯，線粒體膜局部破裂，線粒體嵴呈絮狀改變或者腫脹而大小不一，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到晶格狀的病毒顆粒，呈黑色點(diǎn)狀排列。RT-PR可從感染VB3的心肌細(xì)胞擴(kuò)增到VB35-UTR。這些結(jié)果證實(shí)心肌細(xì)胞已經(jīng)被VB3感染，但被感染的心肌細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出類(lèi)似HeLa細(xì)胞的急性細(xì)胞病變效應(yīng)。pNI4含有VB1全長(zhǎng)DNA，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)錄出VB1全長(zhǎng)RNA基因組，并在細(xì)胞中復(fù)制增殖出大量完好VB1病毒，我們將pNI4轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，結(jié)果雖然可以通過(guò)RT-PR檢測(cè)到VB15-UTR，卻不能看到細(xì)胞病變類(lèi)似VB3攻擊HeLa細(xì)胞的表現(xiàn)。檢測(cè)感染或轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，可見(jiàn)心肌酶的程度和對(duì)照細(xì)胞相比有變化，說(shuō)明VB感染