植物基因功能研究策略

1、植物基因功能研究策略第一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月目錄基因功能研究的內(nèi)容基因功能研究的意義基因功能研究的現(xiàn)狀基因功能研究策略 正向遺傳學(xué)策略 反向遺傳學(xué)策略第二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月What is gene?In Genetics the basic unit of heredity that is transmitted from parents to offspring in reproduction, which determines inherited traits.In Molecular Biology - entire nucleic

2、acid sequence necessary for the synthesis of a functional polypeptide (protein chain) or functional RNA現(xiàn)代對(duì)基因的定義是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列總稱，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。第三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月What is Gene expression?第四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月基因功能研究的內(nèi)容基因功能研究?jī)?nèi)容功能基因鑒定基因表達(dá)規(guī)律基因產(chǎn)物生化功能基因表達(dá)的生理功能第五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因功

3、能研究的目標(biāo) 確定和理解決定植物生命活動(dòng)的所有基因，從分子、生化和生理水平上揭示植物生命活動(dòng)機(jī)理。這些知識(shí)最終將會(huì)提高人類駕馭植物生產(chǎn)的能力。第六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因功能研究的重要意義提高利用常規(guī)方法培育新品種的能力；提高利用基因工程手段改良植物品種的能力；采取更有針對(duì)性的栽培生產(chǎn)措施，提高生產(chǎn)效率；更有效的利用植物資源生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品；提高對(duì)珍稀植物的保護(hù)能力。第七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因功能研究的現(xiàn)狀在擬南芥、水稻基因組和其它作物已完成測(cè)定的序列中，只有部分基因進(jìn)行了功能研究。多數(shù)只通過ESTs和OFR等進(jìn)行了鑒定。許多基

4、因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的確切功能和作用還不清楚?；驕y(cè)序的步伐遠(yuǎn)大于基因功能研究的腳步，公共數(shù)據(jù)庫的DNA序列每天都以數(shù)萬核苷酸的速度增加。第八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA序列的主要數(shù)據(jù)庫/ National Center for Biotechnology Information / MaizeGDB is funded by a cooperative agreement through the USDA Agricultural Research Service.植物基因功能研究的現(xiàn)狀第九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因功能研究的現(xiàn)狀第十張，PP

5、T共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA序列的主要數(shù)據(jù)庫/ SGDTM（ Saccharomyces Genome Database）is a scientific database of the molecular Saccharomyces biology and genetics of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is commonly known as bakers or budding yeast. 植物基因功能研究的現(xiàn)狀第十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月

6、第十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因功能研究策略正向遺傳學(xué)策略 forward genetics strategy反向遺傳學(xué)策略 reverse genetics strategy第十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略forward genetics strategy表現(xiàn)型 基因型Phenotype Genotype第十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略誘變 突變體篩選 克隆基因 基因功能技術(shù)路線第十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略基

7、因突變基因失活或產(chǎn)物無功能recessive基因表達(dá)減弱或產(chǎn)物活性降低基因表達(dá)加強(qiáng)或產(chǎn)物具有新功能dominant基因突變類型第十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略誘變劑 Mutagenesis化學(xué)誘變劑 Chemical mutagens輻射 RadiationTDNA和 轉(zhuǎn)座子插入 TDNA or transposon insertion 誘 變第十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因突變的分子基礎(chǔ)按突變發(fā)生的原因分類 自發(fā)突變(spontaneous mutation):在自然狀況下發(fā)生的突變。 誘發(fā)突變(induced mutation):

8、有機(jī)體暴露在誘變劑中引起的突變。一.自發(fā)突變的分子基礎(chǔ) 自發(fā)突變可能由DNA復(fù)制錯(cuò)誤,自發(fā)損傷和轉(zhuǎn)座因子等多種原因引起。(一)DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤 遺傳物質(zhì)是DNA,DNA復(fù)制是半保留復(fù)制,如果發(fā)生錯(cuò)誤,引起堿基替換(base substitution), 即一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基替換，造成DNA遺傳信息的改變。從而導(dǎo)致基因突變。第二十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 正常情況下,A-T配對(duì),氨基態(tài)的腺嘌呤(A)只與胸腺嘧啶(T)配對(duì),但有時(shí)可轉(zhuǎn)變成稀有的亞氨基形式,可以與胞嘧啶配對(duì),形成A-C, 再經(jīng)一次復(fù)制,DNA分子中的A-T對(duì)變成了G-C對(duì). 這種互變異構(gòu)可以在DNA復(fù)制中自

9、發(fā)產(chǎn)生。第二十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月堿基替換可以分為轉(zhuǎn)換和顛換: 1.轉(zhuǎn)換(transitions):嘌呤替代嘌呤,或嘧啶替代嘧啶。 AG或GA , TC或CT 2.顛換(Tran versions):嘌呤替代嘧啶,或嘧啶替代嘌呤。 AC, AT , CA, TA 3.移碼突變（frame-shift mutation）:在DNA復(fù)制中發(fā)生增加或減少一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)所造成的突變。移碼突變可造成蛋白質(zhì)分子發(fā)生較大的結(jié)構(gòu)改變。 第二十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月(二) 自發(fā)損傷(spontaneous lesions) 即自然產(chǎn)生的DNA損傷引起突變,

10、如脫嘌呤和脫氨基等。 1.脫嘌呤：最為常見，由于DNA分子中堿基和脫氧核糖間的糖苷鍵受到破壞，從而引起一個(gè)鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(a)從DNA分子上脫落下來。造成DNA損傷，產(chǎn)生無嘌呤位點(diǎn)，在DNA復(fù)制中引入錯(cuò)誤；或由修復(fù)系統(tǒng)移去無嘌呤位點(diǎn)或插入一個(gè)堿基而引起突變。 2.脫氨基：胞嘧啶脫氨基變成U,U與A配對(duì)，結(jié)果使 G-C對(duì)變成 A-T對(duì)（轉(zhuǎn)換)。 3.氧化性損傷：個(gè)體自然產(chǎn)生的氧化基，氧化物如超氧自由基,氫氧自由基及過氧化基等，能對(duì)DNA造成氧化性損傷，引起突變，導(dǎo)致人類疾病。 第二十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月烯醇式結(jié)構(gòu)第二十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年

11、6月玉米中控制分枝的tb1基因是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，該基因上游41kb作為順式調(diào)控因子，調(diào)控tb1基因的表達(dá)，玉米中tb1的表達(dá)量是大芻草中的2倍，該基因表達(dá)上的變化造成玉米和大芻草形態(tài)上的巨大差異。Nature, 1997, 386: 485-488第二十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月玉米中tga1基因控制穎殼的有無，該性狀只有一個(gè)基因控制，由于tga1基因一個(gè)氨基酸的替換，造成玉米和大芻草如此巨大的表型差異。Nature, 2005, 436: 714-719第二十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻落?；蛟?006年的science上有兩篇文章，一篇是比較i

12、ndica和野生稻sh4，是由于一個(gè)氨基酸的替換造成的，另一篇是日本人做的，比較indica和japonica的qSH1，此基因是由于調(diào)控區(qū)一個(gè)SNP引起的。 Science, 2006, 311: 1936-1939第二十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月小麥的Q基因具有多效性，影響到脫粒、小穗長(zhǎng)度，株高和抽穗等一系列性狀。該基因也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。也是由于一個(gè)氨基酸的替換影響了同源二聚體的形成。Genetics, 2006, 172: 547-555第二十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月小麥中的Gpc-B1基因，NAC類轉(zhuǎn)錄因子，在野生小麥中由于該基因的表達(dá)，籽

13、粒蛋白含量、鋅和鐵含量較栽培小麥提高很大，而栽培小麥中，該基因由于一個(gè)堿基的插入造成移碼突變而失活，但卻使持綠性增強(qiáng)。Science, 2006, 314: 1298-1301第二十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月擬南芥中控制種子大小的AP2基因突變體中在第一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域有一個(gè)11bp的缺失，造成null mutation，結(jié)果種子增大，細(xì)胞數(shù)增大，細(xì)胞體積增大。PNAS, 2005, 102: 3123-3128第三十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月控制番茄果型大小的fw2.2是最早克隆的QTL，僅僅因?yàn)槌墒焱砥诒磉_(dá)豐度的不同，造成野生型和栽培型果型大小的如此

14、大的差別。Science, 2000, 289:85-88第三十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 二 誘發(fā)突變的分子基礎(chǔ) 各種誘變劑（物理或化學(xué)的）可誘發(fā)基因的突變。誘變劑可以取代堿基，改變堿基或破壞堿基，使DNA發(fā)生錯(cuò)配，而引起基因突變。(一)堿基類似物：與堿基結(jié)構(gòu)類似，可替代正常堿基摻入DNA分子，引起堿基替換。如5-溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶T的類似物，可摻入DNA分子中。BU有兩種互變異構(gòu)體酮式和烯醇式。酮式與A配對(duì)，而烯醇式與G配對(duì)，這樣很容易引起G-C對(duì)與A-T對(duì)的互相轉(zhuǎn)換。除BU外，5-溴脫氧尿苷（BrdU），5-尿嘧啶，5-氯尿嘧啶及其脫氧核苷。2-氨基嘌呤（2

15、-AP）等都是堿基類似物。第三十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略mispairingATABuGBuGCBumutation堿基類似物誘變機(jī)制誘 變 第三十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)烷化劑：常用的烷化劑有硫酸二乙脂（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、異丙基甲烷磺酸酯（iPMS）、芥子氣類。另外，亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基乙基脲（NEH）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、乙烯亞胺（EI）、1,4-雙重氮乙酰丁烷，也是有效的誘變劑，但是有毒，應(yīng)用危險(xiǎn)，是潛在致癌物質(zhì)第三十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6

16、月(三)嵌合劑：吖啶類染料的分子為平面結(jié)構(gòu)，大小與堿基對(duì) 差不多，可插入DNA雙鏈核心堆積的堿基對(duì)之間，在嵌入的位置引起單 個(gè)堿基對(duì)的插入或缺失，造成移碼突變。如口丫啶橙，溴化已啶（EB），原黃素和黃素等。(四)紫外線（UV）:可使DNA產(chǎn)生很多光生成物，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體。(五)電離輻射：使DNA分子發(fā)生氫鍵斷裂，DNA單鏈或雙鏈斷裂，堿基或糖基損傷，DNA，蛋白質(zhì)相互交聯(lián)等。x射線，射線等，具有較高的能量可引起原子的電離，導(dǎo)致DNA的損傷，基因突變和染色體結(jié)構(gòu)變異。(六)黃曲霉素B1(AFB1)：霉變的花生等食物中含有大量的AFB1 ，AFB1是一種強(qiáng)致癌劑?？稍贕的N-T位形成一個(gè)加成復(fù)

17、合物即產(chǎn)生無嘌呤位點(diǎn)，使GC顛換為T-A，引起基因突變?？蓪?dǎo)致肝癌。 第三十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月其它誘變劑：如亞硝酸、羥胺（NH2OH）、氮蒽、疊氮化鈉（NaN3）等物質(zhì)，均能引起染色體畸變和基因突變。尤其是疊氮化物在一定條件下可獲得較高的突變頻率，而且相當(dāng)安全，無殘毒。亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。 HNO2胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） HNO2腺嘌呤（A） 次黃嘌呤（H） HNO2鳥嘌呤（G） 黃嘌呤（X） 這些反應(yīng)及形成物均可在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)換。第三十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略ATHTHCGCH

18、NO2mispairingmutation化學(xué)誘變機(jī)制誘 變 第三十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月基因突變對(duì)遺傳信息的影響(一）堿基替換的影響：?jiǎn)蝹€(gè)堿基替換如果發(fā)生在基因編碼區(qū)，則會(huì)改變一個(gè)密碼子，可以引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中某個(gè)氨基酸的變化。 1 同義突變(samesense mutation) ：由于遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性。所以有時(shí)堿基替換密碼子改變但并不改變氨基酸。如GAUGAC，但仍是天冬AA，無突變效應(yīng)，密碼子的簡(jiǎn)并性大大削弱了突變的危害性，是DNA的容錯(cuò)機(jī)制。 2 錯(cuò)義突變（missense mutation）：指堿基替換密碼子改變引起氨基酸的改變。錯(cuò)義突變使蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)

19、構(gòu)改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性和功能不同程度的改變。一般性質(zhì)相似的氨基酸替換對(duì)蛋白質(zhì)的影響小，而性質(zhì)不同的氨基酸的替換可能強(qiáng)烈的影響蛋白質(zhì)的功能。 第三十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3 無義突變（nonsense mutation):堿基替換使編 碼氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，轉(zhuǎn)錄出的mRNA在翻譯時(shí)提前終止，形成的肽鏈不完全，一般沒有活性。形成的終止密碼子為UAG、UAA或UGA 。 4 通讀（reading through):堿基替換使終止密碼子突 變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼子，轉(zhuǎn)錄出的mRNA在翻譯時(shí)不能適時(shí)終止，直到另一終止密碼子為止。 移碼突變的影響：在DNA分子的外顯子中

20、遺傳信 息是按三聯(lián)體密碼子排列的，插入或缺失個(gè)或個(gè)或個(gè)堿基會(huì)改變閱讀框架，結(jié)果翻譯出來的蛋白質(zhì)的氨基酸序列也完全改變，但如果插入或缺失個(gè)堿基，則在翻譯出的多肽鏈上只是多或少一個(gè)AA，而不會(huì)完全打亂AA序列。第三十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 突變熱點(diǎn)和增變基因：理論上，DNA任何位點(diǎn)都可以發(fā)生突變，但實(shí)際上DNA分子上不同部位有著不同的突變率。 1 突變熱點(diǎn)：突變率大大高于平均突變率的位點(diǎn)。如甲基胞嘧啶（MeC）的存在，MeC脫氨后生成T，不可被校正，而引起突變，C脫氨后變成U，容易被校正。另外一些短的重復(fù)系列也易形成突變熱點(diǎn)，易發(fā)生嵌入和缺失，因DNA復(fù)制前模板鏈與新生鏈

21、之間的滑動(dòng)造成。 2 增變基因（mutator gene）：指某些基因突變后可使整個(gè)基因組中的突變率明顯上升的基因。如DNA聚合酶基因突變，3校正功能降低或喪失，是基因突變率升高。另如dam基因突變，則錯(cuò)配修復(fù)功能喪失，引起突變率升高。 第四十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月射線誘變第四十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略 在基因工程中，T

22、 -DNA中的基因被除掉，保留兩側(cè)的重復(fù)序列，加入欲轉(zhuǎn)移的基因。在用 T- DNA 誘導(dǎo)突變時(shí)，不用加入其它基因。Transposition and transposable elements(Ac/Ds)T-DNA 插入突變誘 變第四十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Ti plasmid130 bpT DNALBRB正向遺傳學(xué)策略 TDNA誘 變 vir genesTDNA 插入突變第四十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Insertional mutagenesis by T-DNA第四十九張，PPT共一百

23、五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月When and Where Mutations HappenIn eukaryotes, mutations that occur in the somatic cells (somatic mutations) are not inherited; mutations that occur any time in the germ line are inherited. We usually measure the rate in mutations per gametesomatic mutationger

24、m line mutationGerm lineSoma第五十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月突變體的篩選方法 第五十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月受細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)控制的遺傳現(xiàn)象，叫做細(xì)胞核遺傳（核遺傳）。細(xì)胞核遺傳母本父本母本父本正交子代反交子代正向遺傳學(xué)策略第五十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞質(zhì)遺傳 受細(xì)胞質(zhì)內(nèi)遺傳物質(zhì)控制的遺傳現(xiàn)象，叫做細(xì)胞質(zhì)遺傳。母本父本母本父本正交子代反交子代正向遺傳學(xué)策略第五十六張，PPT共一百五十七頁

25、，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略根據(jù)發(fā)生突變基因的性質(zhì)，將眾多突變體分成不同的突變系。稱為突變體篩選。常用的篩選方法是互補(bǔ)檢驗(yàn)（complementation test）突變體篩選第五十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略互補(bǔ)檢驗(yàn)（complementation test） 以豌豆花色為例，野生型為紫色，現(xiàn)有一批突變體花色為白色，它們是相同基因突變，還是不同基因突變？ 假定突變都是隱性（recessive）突變。突變體篩選第五十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月正向遺傳學(xué)策略 互補(bǔ)檢驗(yàn)假定兩個(gè)突變體基因型分別為aa 和bb突變體篩選如果a與b是等位基

26、因aaBBAAbbAaBb紫色wildtype白色mutant如果a與b不是等位基因第五十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組圖譜遺傳圖譜（genetic map）物理圖譜（physical map）第六十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜（genetic map） 采用遺傳分析的方法將基因或其它DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。第六十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳標(biāo)記有可以識(shí)別的標(biāo)記，才能確定目標(biāo)的方位及彼此之間的相對(duì)位置。構(gòu)建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標(biāo)記。包括： 形態(tài)標(biāo)記 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 生化標(biāo)記 DNA分子標(biāo)記第六十

27、二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月多態(tài)性（polymophism）所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性！ 花色：白色、紅色 株高：高、矮 血型：A、B、O型 淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結(jié)果！第六十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月形態(tài)標(biāo)記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標(biāo)記數(shù)量少很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響第六十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的。 控制性狀的其實(shí)是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基

28、因標(biāo)記。第六十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月果蠅連鎖圖第六十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞學(xué)標(biāo)記明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征 染色體的核型 染色體的帶型 染色體的結(jié)構(gòu)變異 染色體的數(shù)目變異優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境影響缺點(diǎn)：數(shù)量少、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育不利第六十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月生化標(biāo)記 又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記 就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。 如：同工酶、貯藏蛋白 優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小 缺點(diǎn)：受發(fā)育時(shí)間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息第六十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA

29、分子標(biāo)記簡(jiǎn)稱分子標(biāo)記以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)： 不受時(shí)間和環(huán)境的限制 遍布整個(gè)基因組，數(shù)量無限 不影響性狀表達(dá) 自然存在的變異豐富，多態(tài)性好 共顯性，能鑒別純合體和雜合體第六十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP） DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對(duì)等位基因的差異。 如有兩個(gè)DNA分子（一對(duì)染色體），一個(gè)具有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒有這個(gè)位點(diǎn)，酶切后形成的DNA片段長(zhǎng)度就有差異，即多態(tài)性。 可將RFLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。人類基因

30、組中有105個(gè)RFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩個(gè)等位基因。第七十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月RFLP分析第七十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記微衛(wèi)星又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）。這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC 另一染色體 TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構(gòu)成了多態(tài)性。第七十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜的構(gòu)建方法 理論基礎(chǔ): 連鎖與交換 基本方法: 兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)

31、法第七十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物遺傳圖譜的構(gòu)建 選擇研究材料（親本） 構(gòu)建分離群體 遺傳標(biāo)記檢測(cè) 標(biāo)記間的連鎖分析第七十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇親本 要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異大 但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。 對(duì)備選材料進(jìn)行多態(tài)(差異)性檢測(cè)，綜合測(cè)定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對(duì)或幾對(duì)材料作為遺傳作圖親本。第七十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)建作圖群體 第七十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記間的連鎖分析利用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離群體中所有個(gè)體的基因型根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之

32、間的連鎖關(guān)系和遺傳距離有計(jì)算機(jī)軟件可以應(yīng)用第七十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜的缺陷 分別率有限 人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個(gè)體 測(cè)序要求每個(gè)標(biāo)記的間隔小于100kb 實(shí)際是599kb精確性不夠經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，交換是隨機(jī)發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點(diǎn)倒位、重復(fù)等染色體結(jié)構(gòu)變異會(huì)限制交換重組第七十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月物理圖譜的構(gòu)建 用分子生物學(xué)方法直接檢測(cè)DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。 有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？ 遺傳連鎖圖。它是通過計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定他們的相對(duì)距離，

33、一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。物理圖譜是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離堿基對(duì)(bp) 或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)的圖譜。第七十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母遺傳圖與物理圖比較A 遺傳圖B 物理圖第八十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Comparison of genetic (likage) and physical mapsphysical (bp)genetic (cM)Arabidopsischromosom IV第八十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于20

34、22年6月 基于基因圖譜的基因分離技術(shù)圖譜定位克隆，簡(jiǎn)稱圖位克?。∕ap-based cloning)第八十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、原理：利用同源染色體的隨機(jī)交換和連鎖不平衡的原理，先將與某一特定性狀相關(guān)聯(lián)的目的基因定位到染色體上，在目的基因的兩側(cè)確定一對(duì)與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，接著將位于兩個(gè)分子標(biāo)記間的候選基因DNA片段分離出來，最后再通過遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)鑒定出目的基因。第八十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月特點(diǎn)： 在不知道基因所編碼蛋白信息的條件下分離基因。要求： 1、需要構(gòu)建性狀上存在分離的群體； 2、高密度的分子標(biāo)記圖譜進(jìn)行連鎖分析； 3、

35、需要獲得與性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記； 4、高質(zhì)量的基因組文庫；第八十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建A、選擇親本B、構(gòu)建作圖群體C、遺傳標(biāo)記的染色體定位D、標(biāo)記間的連鎖分析第八十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月分子標(biāo)記(Molecular markers) A DNA sequence that exists as two or more readily distinguished versions and which can therefore be used to mark a ma

36、p position on a genetic, physical or integrated genome map.即：同源染色體之間DNA序列上的差異，用來表示某個(gè)特定的染色體區(qū)段。第八十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Indica (1)Japonica (1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATG- - - - - - - - - - -CGGCATATGCTATTTTC

37、TTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATSTSs Sequence tagged sitesLeft primerIndica (40) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Japonica (51) TCCATC TTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica (40) - - - - - - - - - - - - - -

38、- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica (41) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTRight primerInDels: i

39、nsertions and deletions第九十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月網(wǎng)站網(wǎng)址Supplemental material for this paper/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.）http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbred map http:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhio Stock Center（U.S.A.） /aims/TAIR database*， hom

40、epage Recombinant Inbred map（mirror site） /cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers /aboutcaps.htmlSequence table /cgi-bin/maps/Seqtable.plSNP collection /SNPs.htmlCEREON collection of polymorphisms /cereonSSLP markers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR， genome annotations /tdb/athl/htmls/index.htmlDatabase of Ler

41、sequences /tdb/atgenome/Ler.htmlKasuza DNA Research Institute， genome annotations http:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS genome annotations http:/websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions http:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：The Arabidopsis

42、Information Resource （TAIR）第九十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Marker1ACAGAGTAGGAGGCAAAC GTCGCGCGTAACGTCACGCGTAACGCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAACGCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC .GCTACTTACACGGACAPrimerPrimer第九十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月雜合=1-(1/2*1/2+ 1/

43、2*1/2)10-20MarkerP1P2P1P2PoolPool第九十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Chr-1Chr-2Chr-3Chr-4Chr-5第九十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月交換率 50% 自由組合交換率50% F1F2第九十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Marker1Marker第一百張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月PoolF1PMarker1第一百零二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第

44、一百零四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月AGeneBCPCR 1.300PCR 1.300第一百零五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Marker1Marker2第一百零七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月RRTarget geneM1M2RRRRRRRRRRTarget geneM1M2初步定位精細(xì)定位第一百一十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻半矮稈基因sd1的克隆圖位克

45、隆法舉例1： 水稻半矮稈基因sd1被稱為“綠色革命基因”，Monna等人通過圖位克隆的方法克隆到，它是編碼赤霉素代謝合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵的酶GA20氧化酶。第一百一十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻高桿和半矮桿植株第一百一十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月半矮桿IndicajaponicaHabatakiSasanishikiF1正常株高SasanishikiSBIL5Marker assistedSelection (MAS)Chr 1SBIL5 F2 segregating population (

46、n=263)第一百一十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月sd-1 can be treated as a mendelian factor in this population第一百一十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百二十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻半矮桿基因的精細(xì)定位通過對(duì)3477個(gè)分離單株的分子標(biāo)記檢測(cè)（

47、CAPS、SNP等）找到了一個(gè)6kb的候選基因區(qū)域。第一百二十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻分蘗基因的克隆圖位克隆法舉例2：理想株型是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外超級(jí)稻研究中的一個(gè)核心領(lǐng)域，即通過改變水稻在分蘗、莖稈、穗粒等方面的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提高水稻產(chǎn)量。對(duì)于分蘗基因的克隆及機(jī)理研究有助于促進(jìn)水稻稈壯穗大的理想株型的實(shí)現(xiàn)，在高產(chǎn)育種中具有重要應(yīng)用前景。 第一百二十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻分蘗是在基部不延長(zhǎng)的節(jié)間形成，并獨(dú)立與主桿生長(zhǎng)。水稻分蘗的發(fā)生分二個(gè)階段：腋芽形成和生長(zhǎng)。第一百二十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月我國(guó)李家洋實(shí)驗(yàn)室克隆到了控制水稻

48、分蘗的基因MONOCULM1（MOC1）。The moc1突變體只有一根主桿，沒有分蘗，因?yàn)椴荒苄纬煞痔Y芽。第一百二十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百二十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 通過PCR方法將MOC1和moc1基因擴(kuò)增出，序列比較后發(fā)現(xiàn)有一個(gè)1.9kb的反向轉(zhuǎn)座因子插入到moc1突變體的ORF中。功能互補(bǔ)試驗(yàn)證明帶有完整的ORF和1.5kb上游啟動(dòng)子序列的克隆pC8247能恢復(fù)分蘗性狀（圖1）。但是，C-端截短的克隆pC8247S不能恢復(fù)分蘗特性。第一百二十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百二十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)

49、作于2022年6月第一百二十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百二十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月總 結(jié)1、從性狀的差異到基因，屬于正向遺傳學(xué)范疇；2、親本選擇性狀上存在顯著差異的材料，獲得性狀分離的后代群體；3、親本選擇秈稻、粳稻亞種，便于發(fā)展高密度的分子標(biāo)記；4、通過尋找交換單株來確定緊密連鎖的兩側(cè)分子標(biāo)記；5、利用基因組文庫或PCR的方法分離獲得特殊功能的基因。第一百三十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月存在的問題圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因。在分析自然發(fā)生的變異的時(shí)候，我們最有可能遇到

50、的復(fù)雜情況是一個(gè)給定的性狀是由不止一個(gè)的基因位點(diǎn)控制的。例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之間的雜交實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)粉狀霉菌抗性基因至少涉及三個(gè)遺傳位點(diǎn)，它們是以附加的方式起作用的（I.Wilson， C. Schiff， 和 S. Somerville， 個(gè)人交流）。對(duì)這些抗性基因中的任何一個(gè)作精細(xì)定位都要求降低作圖群體的遺傳復(fù)雜性，例如通過創(chuàng)造只有一個(gè)位點(diǎn)保持多態(tài)性的重組近交系。在擬南芥的株系之 間雜交時(shí)，很多種性狀是由一個(gè)或多個(gè)遺傳位點(diǎn)控制的，其中包括開花時(shí)間，種子大小，冬眠，生理節(jié)律，次生代謝以及表皮毛的密度（綜述見Alonso-Blanco 和 K

51、oornneef，2000）。無論何時(shí)，當(dāng)影響這些性狀的自然或者誘導(dǎo)的突變被定位的時(shí)候，第二位點(diǎn)修飾成分會(huì)干擾這些分析。第一百三十一張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月表觀（上位）遺傳突變這個(gè)術(shù)語是描述一個(gè)基因在表達(dá)和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變（綜述見Wolffe 和 Matzke,1999），已有文獻(xiàn)很好地證明的是花發(fā)育基因SUPERMAN的后生clark kant等位基因（Jacobson 和 Meyerowitz，1997）。這些等位基因是可遺傳的，但它們不穩(wěn)定有一個(gè)小的回復(fù)率。它們?cè)赟UPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化現(xiàn)象，結(jié)果，有可能

52、減少了SUPERMAN基因轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)。它們中沒有一個(gè)是和SUPERMAN的DNA序列改變聯(lián)系在一起的；盡管如此，它們能被帶有SUPERMAN基因的轉(zhuǎn)基因所補(bǔ)充。目前，對(duì)于這種表觀遺傳突變是怎么產(chǎn)生的以及它們出現(xiàn)的頻率知道的不多。第一百三十二張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月關(guān)于染色體上位點(diǎn)的物理和遺傳距離的比值是變化的。通常這種變化是比較小的，對(duì)作圖的分辨率也只有較小的影響（Copenhaver等，1998）。但是，有證據(jù)表明有些染色體區(qū)域是例外的。例如，對(duì)GURKE基因的圖位克隆就非常困難，這個(gè)基因的定位接近于第一條染色體的著絲粒；在著絲粒附近重組是嚴(yán)格限制的，使得對(duì)它精細(xì)定位

53、的努力非常無效。而且，在這個(gè)區(qū)域中重復(fù)DNA單元的廣泛分布使我們辨認(rèn)出散布的單拷貝序列，這些單拷貝序列能產(chǎn)生有疑問的遺傳標(biāo)記（R. Torres Ruiz，個(gè)人交流）。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是經(jīng)過對(duì)第二條染色體上的物理和遺傳距離之間的比值的系統(tǒng)地分析之后確認(rèn)的（Lin等，1999）。對(duì)這條染色體的幾乎全序列，1%重組的遺傳距離相當(dāng)于100400 Kb的物理距離，平均是250 Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個(gè)顯著的例外，在這里1%重組的遺傳距離相當(dāng)于10002500 Kb?？磥碇档弥赋龅氖窃诂F(xiàn)存的物理圖譜中，擬南芥的五個(gè)著絲粒是沒有一個(gè)被完全覆蓋的。最近對(duì)著絲粒區(qū)域的分析顯示這些區(qū)域通常包含重復(fù)的DNA和幾乎不含表

54、達(dá)的基因（Copenhaver等，1999）。因此，由于接近著絲粒，應(yīng)該沒有擬南芥基因是不服從圖位克隆策略的。第一百三十三張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月除了著絲粒，第二條染色體上也有一個(gè)小片段上1%重組的遺傳距離相當(dāng)于1000 Kb甚至更多。根據(jù)推測(cè)，觀察到的低重組率現(xiàn)象可能是由于被用于作圖分析的株系的DNA序列的重排（Lin等，1999；Mayer等，1999）。第二和第四條染色體的DNA序列的比較顯示有些基因片段是在這兩條染色體之間被復(fù)制的（其中一個(gè)片段的大小是4.6 Mb），還有一個(gè)從線粒體基因組向第二條染色體轉(zhuǎn)移的DNA片段（Lin等，1999）。這些發(fā)現(xiàn)清楚地證明了擬

55、南芥基因組的結(jié)構(gòu)是可以不斷改變的。因此，不同株系之間的遺傳變異可能不僅僅是由點(diǎn)突變和DNA重排導(dǎo)致的，這就從根本上給圖位克隆工程造成了嚴(yán)重的問題。舉例來說，如果在兩個(gè)株系之間發(fā)生倒轉(zhuǎn)的一個(gè)大約500 Kb的序列被用于形成的一個(gè)作圖群體，所有發(fā)生在這個(gè)倒轉(zhuǎn)內(nèi)的重組事件將產(chǎn)生不育的減數(shù)分裂產(chǎn)物。因此，不可能在這個(gè)倒轉(zhuǎn)序列內(nèi)對(duì)突變進(jìn)行作圖。到目前為止，發(fā)生在常見株系之間的這樣的DNA重排還沒有被報(bào)道過，確實(shí)應(yīng)該是這樣，因?yàn)樗鼈兒茈y被檢測(cè)到。在一個(gè)作圖實(shí)驗(yàn)中，它們的出現(xiàn)將很有可能被忽視直到最后一步。 第一百三十四張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 Reverse Geneti

56、cs Strategy基因型 表現(xiàn)型Genotype Phenotype第一百三十五張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 已知序列 預(yù)測(cè)蛋白 基因突變 異體表達(dá) 表達(dá)抑制 表現(xiàn)型變化 基因功能技術(shù)路線第一百三十六張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 基因組測(cè)序 擬南芥、水稻 cDNA文庫 差示法 PCR法 探針法 ESTs法 其它分子標(biāo)記法已知序列來源第一百三十七張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 已知序列來源基因組測(cè)序DNAsegmentsGenome DNAvectorshostReproductionclonesequencing第一百三十八張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月YAC-based physical map of rice chromosome 1 已知序列來源反向遺傳學(xué)策略 基因組測(cè)序第一百三十九張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 已知序列來源cDNA library第一百四十張，PPT共一百五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月反向遺傳學(xué)策略 根據(jù)基因序列，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，再根據(jù)蛋白質(zhì)的保守序列，預(yù)測(cè)其功能。蛋白產(chǎn)物預(yù)測(cè)第一百四十一