葉綠體的分離與熒光觀察實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、姓名：徐靜 科目：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告班級(jí)：10級(jí)生命基地學(xué)號(hào)：201000140121題目：葉綠體的分離與熒光觀察同組者：張姍田娜王安琪.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過(guò)植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。實(shí)驗(yàn)原理葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中 進(jìn)行的。由于具有這一重要功能，所以它一直是細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生 物學(xué)的重要研究對(duì)象。葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，利用低速離心 即可分離集中進(jìn)行各種研究。葉肉細(xì)胞中的葉綠體內(nèi)含葉綠素，使植物呈現(xiàn)綠色。葉綠體是細(xì)胞內(nèi)扁 平的橢球形或球形的三

2、個(gè)雙層膜細(xì)胞器之一，葉綠體內(nèi)基粒是光合作用的場(chǎng) 所。高等植物（如葫蘆蘚）的葉綠體呈橢球狀，在不同的光照條件下，葉綠體 可以運(yùn)動(dòng)，改變橢球體的方向，這樣既能接受較多的光照，又不至于被強(qiáng)光灼 傷。在弱光下，葉綠體以其橢球體的正面朝向光源；在強(qiáng)光下，葉綠體以其橢 球體的側(cè)面朝向光源。因此，在不同光照條件下采集的葫蘆蘚，觀察到其小葉 內(nèi)葉綠體的形狀不完全一樣。將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方 法。一個(gè)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離 心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場(chǎng)中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大 小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力

3、和離心時(shí)間，就能夠使非均一 懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲 得各種亞細(xì)胞組分。沉降順序?yàn)椋杭?xì)胞核一線粒體 *溶酶體與過(guò)氧化 氫酶體 *內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體 *核蛋白體。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液（0.35 mol / L氯化鈉或0.4 mol / L蔗糖溶液） 中進(jìn)行.以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。將勻漿液在1000 r/min的條 件下離心2min，以去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞。然后， 在3000 r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。 分離過(guò)程最好在05C的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。熒光

4、顯微術(shù)是利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀測(cè)的一種技術(shù)。 某些物質(zhì)在一定短波長(zhǎng)的光（如紫外光）的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā) 態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光（如可見(jiàn) 光），這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物 質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光（或直接熒光），如葉綠素的 火紅色熒光和木質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒 光染料后同樣也能發(fā)出熒光.這種熒光稱為次生熒光（或間接熒光），如葉綠體 吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將受到許多因素的影 響，如溫度、光、淬滅劑等。

5、因此在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間.有必要時(shí)立即拍 照。另外，在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無(wú)熒光載片、蓋片和無(wú)熒光油。實(shí)驗(yàn)儀器1、器材：（1）主要設(shè)備：普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡。（2）小型器材：燒杯，量筒，滴管，刻度離心管，紗布， 無(wú)熒光載片和蓋片2、材料：新鮮菠菜。3、試劑：0.35 mol / L 氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙（acridine orange）。實(shí)驗(yàn)方法選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦十后去除葉梗及粗脈，稱30g于150ml 0.35mol / L NaCI溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。利用組織搗碎機(jī)低速（5 000 r / min）勻漿35min。將勻漿用6層紗布過(guò)濾于50

6、0ml燒杯中。取濾液4ml在1000 r / min下離心2 min。棄去沉淀。將上清液在3000 r / min下離心5min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。將沉淀用0.35 mol / L NaCl溶液懸浮。取葉綠體懸液一滴滴于載片上，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下 觀察：在普通光鏡下觀察；在熒光顯微鏡下觀察；取葉綠體懸液 一滴滴在無(wú)熒光載片上，再滴加一滴0. 01 %吖啶橙熒光染料，加無(wú)熒光 蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部 含有較深的綠色小顆粒，即基粒。以O(shè)lympus熒光顯微鏡

7、為例，在選用B（blue）激發(fā)濾片、B雙色鏡和0ss。（orange）阻斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光（圖三）。加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光（圖四），而其中混有的細(xì)胞 核則發(fā)綠色熒光。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖圖一普通顯微鏡中菠菜葉的葉綠體（10 x40）圖二 普通顯微鏡中菠菜葉的葉綠體（10 x40）圖三 熒光顯微鏡菠菜葉綠體（未染色）（10 x40） 圖四熒光顯微鏡中菠菜葉綠體（染色）（10 x40）實(shí)驗(yàn)分析差速離心時(shí)要控制號(hào)速度和時(shí)間，否則會(huì)影響最后的葉綠體的觀察，甚至可能無(wú)法分離出葉綠體；差速離心只能得到80%純度的葉綠體，要想獲得更純的葉綠體，可以用密度 梯度離心法；差速離心分