分子生物學(xué)1cDNA與cccDNAcDNA是由mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶合成

1、一、1cDNA 與 cccDNA：cDNA 是由 mRNA 通過反轉(zhuǎn)錄酶的雙鏈DNA；cccDNA 是游離于之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形DNA。2標(biāo)準(zhǔn)折疊：蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元螺旋與折疊通過各種連接多肽可以組成特殊幾何排列的結(jié)構(gòu)塊，此種確定的折疊類型通常稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。幾乎所有的三級(jí)結(jié)構(gòu)都可以用這些折疊類型，乃至他們的組合型來予以描述，因此又將其稱為標(biāo)準(zhǔn)折疊。3CAP：環(huán)腺苷酸（c）受體蛋白 CRP（creceptor protein ），c與 CRP結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱激活蛋白 CAP（cactivated protein ）4回文序列：DN段上的一段所具有的反向互補(bǔ)序列，常是限制性酶切位點(diǎn)。5m

2、icRNA：互補(bǔ)干擾 RNA 或稱反義RNA，與 mRNA 序列互補(bǔ)，可抑制 mRNA 的翻譯。6核酶：具有催化活性的RNA，在 RNA 的剪接加工過起到自我催化的作用。7模體：蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)中存在著某些形狀和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)頗為類似的局部區(qū)域8信號(hào)肽：在蛋白質(zhì)過N 端有 1536 個(gè)氨基酸殘基的肽段，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜。9弱化子：在區(qū)與結(jié)構(gòu)之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列。10魔斑：當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)過，遇到氨基酸全面缺乏時(shí)，細(xì)菌將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng)，停止全部的表達(dá)。產(chǎn)生這一應(yīng)急反應(yīng)的信號(hào)是鳥苷四磷酸(ppGpp) 和鳥苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp 與 pppGpp 的作用不只是一個(gè)或幾個(gè)子

3、，而是影響一大批，所以稱他們是超級(jí)調(diào)控子或稱為魔斑。11上游啟動(dòng)件：是指對(duì)啟動(dòng)子的活性起到一種調(diào)節(jié)作用的 DNA 序列，-10 區(qū)的A、-35 區(qū)的 TGACA 及增強(qiáng)子，弱化子等。12DNA 探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列 DNA，用以檢測(cè)未知序列、篩選目的等方面廣泛應(yīng)用。13SD 序列：是核糖體與 mRNA 結(jié)合序列，對(duì)翻譯起到調(diào)控作用。14單克隆抗體：只針對(duì)單一抗原決定簇起作用的抗體。15考斯質(zhì)粒：是經(jīng)過人工構(gòu)建的一種外源 DNA 載體，保留噬菌體兩端的 COS 區(qū)，與質(zhì)粒連接。16藍(lán)-白斑篩選：含 LacZ（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-

4、半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA后，LacZ不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。稱之為藍(lán)-白斑篩選。17順式作用元件：在 DNA 中一段特殊的堿基序列，對(duì)的表達(dá)起到調(diào)控作用的元件。18Klenow 酶：DNA 聚合酶 I 大片段，只是從DNA 聚合酶 I 全酶中去除了 5 3外切酶活性19錨定 PCR：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚 dG 的尾巴，然后分別用多聚 dC 和已知的序列作為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。20融合蛋白：真白的與外源連接，同時(shí)表達(dá)翻譯出的原蛋白與外源蛋白結(jié)合在一起所組成的蛋白質(zhì)。二、填 空1 DNA 的物理圖譜是 DNA 分

5、子的（限制性內(nèi)切酶酶解 ）片段的排列順序。2 RNA 酶的剪切分為（自體催化 ）、（異體催化 ）兩種類型。3原核生物中有三種起始因子分別是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4蛋白質(zhì)的跨膜需要（ 信號(hào)肽 ）的引導(dǎo)，蛋白伴侶的作用是（輔助肽鏈折疊成天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)）。5啟動(dòng)子中的元件通常可以分為兩種：（啟動(dòng)件 ）和（上游啟動(dòng)件 ）。6分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要包含（結(jié)構(gòu)分子生物學(xué) ）、（表達(dá)與調(diào)控 ）、（ DNA 重組技術(shù) ）三部分。7證明DNA 是遺傳物質(zhì)的兩個(gè)關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)是（球菌小鼠 ）、（ T2 噬菌體大腸桿菌 ）這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中主要的論點(diǎn)是：（生物體吸收的外源 DNA 改變了其遺傳潛

6、能 ）。8hnRNA 與 mRNA 之間的差別主要有兩點(diǎn)：（ hnRNA 在轉(zhuǎn)變?yōu)?mRNA 的過經(jīng)過剪接，）、（ mRNA 的 5末端被加上一個(gè) m7pGppp 帽子，在 mRNA3末端多了一個(gè)多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。9蛋白質(zhì)多亞基形式的優(yōu)點(diǎn)是（亞基對(duì) DNA 的利用來說是一種經(jīng)濟(jì)的方法 ）、（可以減少蛋白質(zhì)過隨機(jī)的錯(cuò)誤對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響）、（活性能夠非常有效和迅速地被打開和被關(guān)閉 ）。10蛋白質(zhì)折疊機(jī)制首先成核理論的主要內(nèi)容包括（成核 ）、（結(jié)構(gòu)充實(shí)）、（最后重排）。11半乳糖對(duì)細(xì)菌有雙重作用；一方面（可以作為碳源供細(xì)胞生長(zhǎng) ）；另一方面（它又是細(xì)胞壁的成分 ）。所以需要一個(gè)不依賴

7、于 cCRP 的啟動(dòng)子 S2 進(jìn)行本底水平的型；同時(shí)需要一個(gè)依賴于 cCRP 的啟動(dòng)子 S1 對(duì)高水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。有 G 時(shí)轉(zhuǎn)錄從（ S2 ）開始，無G 時(shí)轉(zhuǎn)錄從（ S1 ）開始。12DNA 重組技術(shù)也稱為（克?。┗颍ǚ肿涌寺?）。最終目的是（把一個(gè)生物體中的遺傳信息DNA 轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體）。典型的 DNA 重組實(shí)驗(yàn)通常包含以下幾個(gè)步驟：提取供體生物的目的（或稱外源），酶接連接到另一 DNA 分子上（克隆載體），形成一個(gè)新的重組DNA 分子。將這個(gè)重組 DNA 分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中保存，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)化。對(duì)那些吸收了重組DNA 的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。對(duì)含有重組 DNA 的細(xì)胞進(jìn)行

8、大量培養(yǎng)，檢測(cè)外援是否表達(dá)。13、質(zhì)粒的類型有兩種：受到宿主細(xì)白質(zhì)的嚴(yán)格控制的稱為（型質(zhì)粒），不受宿主細(xì)白質(zhì)的嚴(yán)格控制稱為（ 松弛型質(zhì)粒 ）。14PCR 的反應(yīng)體系要具有以下條件：a、被分離的目的兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的 DNA 引物（約 20 個(gè)堿基左右）。b、具有熱穩(wěn)定性的酶如：TagDNA 聚合酶。c、dNTPd、作為模板的目的DNA 序列15PCR 的基本反應(yīng)過程包括：（變性）、（退火）、（延伸 ）三個(gè)階段。16、轉(zhuǎn)動(dòng)物的基本過程通常包括：將克隆的外源導(dǎo)入到一個(gè)卵或胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核中；接種后的卵或胚胎干細(xì)胞移植到雌性的；完成胚胎發(fā)育，生長(zhǎng)為后代并帶有外源；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物

9、作為種畜，培育新的純合系。17雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生是由（脾 B）細(xì)胞與（骨髓瘤 ）細(xì)胞雜交產(chǎn)生的，由于（脾細(xì)胞）可以利用次黃嘌呤，（ 骨細(xì)胞 ）提供細(xì)胞功能，所以能在 HAT 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。18隨著研究的深入第一代抗體稱為（多克隆抗體）、第二代（單克隆抗體）、第三代（基因工程抗體 ）。19目前對(duì)昆蟲的工程改造主要集中于桿狀，表現(xiàn)在引入（外源毒蛋白）；（ 擾亂昆蟲正常生活周期的）；（ 對(duì)進(jìn)行修飾 ）。20哺乳類RNA 聚合酶啟動(dòng)子中常見的元件A、GC、CAAT 所對(duì)應(yīng)的反式作用蛋白因子分別是（ TFIID ）、（ SP-1 ）和（ CTF/NF1 ）。21RNA 聚合酶的基本轉(zhuǎn)錄因子有、TF-A、

10、TF-B、TFII-D、TF-E 他們的結(jié)合順序是： （ D、A、B、E ）。其中 TFII-D 的功能是（與A 盒結(jié)合 ）。22與 DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子大多以二聚體形式起作用，轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 結(jié)合的功能域常見有以下幾種（ 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 ）、（ 鋅指模體 ）、（堿性-亮氨酸拉鏈模體 ）。23限制性內(nèi)切酶的切割方式有三種類型分別是（在對(duì)稱軸 5 側(cè)切割產(chǎn)生 5 粘端 ）、（在對(duì)稱軸 3 側(cè)切割產(chǎn)生 3 粘端（在對(duì)稱軸處切割產(chǎn)生平段）。24質(zhì)粒DNA 具有三種不同的構(gòu)型分別是：（ SC 構(gòu)型 ）、（ oc 構(gòu)型 ）、（ L 構(gòu)型 ）。在電泳中最前面的是（ SC 構(gòu)型 ）。25外源表達(dá)系統(tǒng)

11、，主要有（大腸桿菌）、（ 酵母）、（ 昆蟲 ）和（ 哺乳類細(xì)胞表 ）。26轉(zhuǎn)動(dòng)物常用的方法有：（逆轉(zhuǎn)錄法）、（DNA顯微注射法）、（胚胎干細(xì)胞法 ）。三、簡(jiǎn) 答1 分別說出 5 種以上RNA 的功能？轉(zhuǎn)運(yùn) RNA tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸白體RNA rRNA白體組成成信使 RNA mRNA 蛋白質(zhì)模板不均一核RNA hnRNA 成熟 mRNA 的前體小核 RNA snRNA 參與 hnRNA 的剪接小胞漿 RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的信號(hào)識(shí)別體的組成成分反義 RNA anRNA/micRNA 對(duì)的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的 RNA2原核生物

12、與真核生物啟動(dòng)子的主要差別？原核生物TTGACA -AAT起始位點(diǎn)-35 -10真核生物增強(qiáng)子-GC -CAAT-AA5mGpp起始位點(diǎn)-110 -70 -253對(duì)天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：a、加入合適的選擇標(biāo)記，如兩個(gè)以上，易于用作選擇,通常是抗生素。b、增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。c、縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。d、改變子，變?yōu)樗沙?，變少拷貝為多拷貝。e、根據(jù)工程的特殊要求加裝特殊的元件4舉例說明差示篩選組織特異 cDNA 的方法？?jī)煞N細(xì)胞群體，目的在其中一種細(xì)胞中表達(dá)或高

13、表達(dá)，在另一種細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，然后通過雜交對(duì)比找到目的。例如：在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過，腫瘤細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)與正常細(xì)胞表達(dá)水平不同的 mRNA，因此，可以通過差示雜交篩選出與腫瘤相關(guān)的。也可利用誘導(dǎo)的方法，篩選出誘導(dǎo)表達(dá)的。5雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生與篩選？脾 B 細(xì)胞+骨髓瘤細(xì)胞，加聚乙二醇（PEG）促進(jìn)細(xì)胞融合，HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)（內(nèi)含次黃嘌呤、氨基蝶呤、T）生長(zhǎng)出來的脾 B-骨髓瘤融合細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞融合物中包含：脾-脾融合細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，脾細(xì)胞不能體外培養(yǎng)。骨-骨融合細(xì)胞：不能利用次黃嘌呤，但可通過第二途 徑利用葉酸還原酶嘌呤。氨基蝶呤對(duì)葉酸還原酶有抑制作用，因此不能生長(zhǎng)。骨-脾融合細(xì)胞：

14、在 HAT 中能生長(zhǎng)，脾細(xì)胞可以利用次黃嘌呤，骨細(xì)胞提供細(xì)胞功能。6、利脫氧末端終止法（Sanger 法）測(cè)定 DNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)的原理與方法？原理是采用核苷酸鏈終止劑2，3，-雙脫氧核苷酸終止 DNA 的延長(zhǎng)。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂鍵所需要的 3-OH，一旦參入到 DNA 鏈中，此 DNA 鏈就不能進(jìn)一長(zhǎng)。根據(jù)堿基配對(duì)原則，每當(dāng) DNA 聚合酶需要 dNMP 參入到正常延長(zhǎng)的 DNA 鏈中時(shí)，就有兩種可能性，一是參入 ddNTP,結(jié)果導(dǎo)致脫氧核苷酸鏈延長(zhǎng)的終止；二是參入 dNTP,使 DNA鏈仍可繼續(xù)延長(zhǎng)，直至參入下一個(gè) ddNTP。根據(jù)這一方法，就到一組以 ddNTP 結(jié)尾的長(zhǎng)短不一

15、的 DN段。方法是分成四組分別為 dd、ddGMP、ddCMP、ddTMP 反應(yīng)后，聚丙烯酰胺凝膠電泳按泳帶可讀出DNA 序列。7、激活蛋白（CAP）對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用？環(huán)腺苷酸（c）受體蛋白 CRP（creceptor protein），c與 CRP 結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱激活蛋白 CAP（cactivated protein ）。當(dāng)大腸桿菌生長(zhǎng)在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中時(shí)，CAP量增加，CAP 具有激活乳糖（Lac）等啟動(dòng)子的功能。一些依賴于CRP 的啟動(dòng)子缺乏一般啟動(dòng)子所具有的典型的-35 區(qū)序列特征（TTGACA）。因此 RNA 聚合酶難以與其結(jié)合。CAP 的存在（功能）：能顯著提高酶與啟

16、動(dòng)子結(jié)合常數(shù)。主要表現(xiàn)以下二方面：CAP 通過改變啟動(dòng)子的構(gòu)象以及與酶的相互作用幫助酶分子正確定向,以便與-10 區(qū)結(jié)合，起到取代-35 區(qū)功能的作用。CAP 還能抑制 RNA 聚合酶與DNA 中其它位點(diǎn)的結(jié)合，從而提高與其特定啟動(dòng)子結(jié)合的概率。8、典型的DNA 重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？a、提取供體生物的目的（或稱外源），酶接連接到另一 DNA 分子上（克隆載體），形成一個(gè)新的重組DNA 分子。b、將這個(gè)重組 DNA 分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中保存，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)化。c、對(duì)那些吸收了重組DNA 的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。d、對(duì)含有重組 DNA 的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測(cè)外援是否表達(dá)。9、文

17、庫的構(gòu)建對(duì)重組子的篩出 3 種方法并簡(jiǎn)述過程?？股乜剐院Y選、抗性的失活、蘭-白斑篩選 或PCR 篩選、差式篩選、DNA 探針多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性（抗氨芐青霉素、四環(huán)素）。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中后，該菌便獲得抗性，沒有轉(zhuǎn)入的不具有抗性。但不能區(qū)分是否已重組。在含有兩個(gè)抗性的載體中，如果外源 DN段其中一個(gè)并導(dǎo)致該失活，就可用兩個(gè)分別含不同藥物的平板對(duì)照篩選陽性重組子。 如 pUC 質(zhì)粒含LacZ（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源 DNA后，LacZ不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。10、說明通

18、過胚胎干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)動(dòng)物的基本過程？胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎發(fā)育期的胚細(xì)胞，可以人工培養(yǎng)增殖并具有分化成其它類型細(xì)胞的功能。ES 細(xì)胞的培養(yǎng)：分離胚泡的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)。ES 在無飼養(yǎng)層中培養(yǎng)時(shí)會(huì)分化為肌細(xì)胞、N 細(xì)胞等多種功能細(xì)胞，在含有成細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí) ES 將保持分化功能?？梢詫?duì) ES 進(jìn)行操作，不影響它的分化功能可以定點(diǎn)整合，解決了隨機(jī)整合。向胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入外源，然后植入到待孕雌鼠，發(fā)育成幼鼠，雜交獲得純合鼠。一、1、：能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和RNA 的 DNA 序列，是決定遺傳性狀的功能。 2、組：細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。

19、3、端粒：以線性形式存在的真核組 DNA 末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒。該結(jié)構(gòu)是一段 DNA 序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細(xì)胞末端存在。4、子：是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)串聯(lián)在一起，信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子和）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所的表達(dá)，所轉(zhuǎn)錄的RNA 為多順反子。 5、 順式作用元件：是指那些與結(jié)構(gòu)表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的特異 DNA 序列。包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等。 6、 反式作用因子：是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。 7、 啟動(dòng)子：是 RNA 聚合酶特

20、異性識(shí)別和結(jié)合的 DNA 序列。 8、 增強(qiáng)子：位于真核中遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，能明顯增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的特殊 DNA 序列。它可位于被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄的上游或下游，也可相距靶較遠(yuǎn)。 9、表達(dá)：是指生物組中結(jié)構(gòu)所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程。 10、 信息分子：調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。其中由細(xì)胞的調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞間信息分子；而在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息調(diào)控信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞內(nèi)信息分子。11、 受體：是存在于靶細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合，進(jìn)而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的的特殊蛋白質(zhì)。 12、 分子克?。涸隗w

21、外對(duì) DNA 分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該 DNA 分子的大量拷貝。 13、 蛋白激酶：是指能夠?qū)⒘姿釓牧姿峁w分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶。 14、 蛋白磷酸酶：是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開關(guān)系統(tǒng)。 15、工程：有目的的通過分子克隆技術(shù)，人為的操作改造，改變生物遺傳性狀的系列過程。 16、載體：能在連接酶的作用下和外源 DN段連接并運(yùn)送 DNA 分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 分子。 17、 轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA 或以它為

22、載體構(gòu)建的重組DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過程。 18、：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞為載體的重組 DNA 分子，在體外經(jīng)過包裝成具有能力的或噬菌體顆粒，才能適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。 19、 轉(zhuǎn)導(dǎo)：指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移 DNA 的過程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞 DNA 的過程。 20、 轉(zhuǎn)染：指或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。 21、 DNA 變性：在物理或化學(xué)的作用下，導(dǎo)致兩條 DNA 鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵則不受影響。 22、 DNA 復(fù)性：當(dāng)促使變性的解除后，兩條 DNA 鏈又可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)。

23、23、 退火：指將溫度降至引物的 TM 值左右或以下，引物與 DNA 摸板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈。 24、 筑巢 PCR：先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為摸板擴(kuò)增獲取目的?？梢蕴岣?PCR 的效率和特異性。 25、 原位 PCR：以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的 DNA或 RNA 作為靶序列，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)的過程。 26、 定量 PCR：表達(dá)涉及的轉(zhuǎn)錄水平的研究常需要對(duì)mRNA 進(jìn)行定量測(cè)定，對(duì)此采用的 PCR 技術(shù)就叫定量PCR。27、打靶：是指通過 DNA 定點(diǎn)同源重組，改變組中的某一特定，從而在生物內(nèi)研究此的功能。 28、 DNA：DNA技術(shù)是指在固相支持物上原位寡核

24、苷酸或者直接將大量的 DNA 探針以顯微打印的方式有序地于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用計(jì)算機(jī)硅作為固相支持物，所以稱為 DNA。 29、 錯(cuò)義突變：DNA 分子中堿基對(duì)的取代，使得 mRNA 的某一子發(fā)生變化，由它所編碼的氨基酸就變成另一種的氨基酸，使得多肽鏈中的氨基酸順序也相應(yīng)的發(fā)生改變的突變。30、 無義突變：由于堿基對(duì)的取代，使原來可以翻譯某種氨基酸的子變成了終止子的突變。 31、 同義突變：堿基對(duì)的取代并不都是引起錯(cuò)義突變和翻譯終止，有時(shí)雖然有堿基被取代，但在蛋白質(zhì)水平上沒有引起變化，氨基酸沒有被取代，這是因?yàn)橥蛔兒蟮淖雍?/p>

25、原來的子代表同一個(gè)氨基酸的突變。 32、 移碼突變：在編碼序列中，單個(gè)堿基、數(shù)個(gè)堿基的缺失或以及片段的缺失或等均可以使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)體閱讀框發(fā)生改變，不能編碼原來的蛋白質(zhì)的突變。 33、 癌：是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性。當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時(shí)，其產(chǎn)物可使細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。包括癌和細(xì)胞癌。 34、 細(xì)胞癌：存在于正常的細(xì)胞組中，與癌基因有同源序列，具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和發(fā)育等生理功能。在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌叫原癌，當(dāng)其受到某些條件激活時(shí)，結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常，能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 35、癌：存在于（大多是逆轉(zhuǎn)錄）組中能使靶細(xì)胞發(fā)生惡

26、性轉(zhuǎn)化的。它不編碼結(jié)分，對(duì)無作用，但是當(dāng)受到外界的條件激活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。 36、：以 DNA或 RNA 為材料，通過檢查的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)的狀態(tài)和疾病作出的方法和過程。 37、 RFLP：即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，之間 DNA的核苷酸序列存在差異，稱為 DNA 多態(tài)性。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為 RFLP。 38、治療：一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞，以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法。 39、 反義 RNA：堿基序列正好與有意義的 mRNA 互補(bǔ)的RNA 稱為反義 RNA?？梢宰鳛橐?/p>

27、種調(diào)控特定表達(dá)段。 40、核酶：是一種可以催化 RNA 切割和RNA 剪接反應(yīng)的由RNA 組成的酶，可以作為表達(dá)和的抑制劑。 34、 細(xì)胞癌：存在于正常的細(xì)胞組中，與癌有同源序列，具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和發(fā)育等生理功能。在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌叫原癌，當(dāng)其受到某些條件激活時(shí)，結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常，能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 35、癌：存在于（大多是逆轉(zhuǎn)錄）組中能使靶細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的。它不編碼結(jié)分，對(duì)無作用，但是當(dāng)受到外界的條件激活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。 36、：以 DNA 或RNA 為材料，通過檢查的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)的狀態(tài)和疾病作出的方法和過程。 37、 RFLP：即

28、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，之間DNA 的核苷酸序列存在差異，稱為 DNA 多態(tài)性。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為 RFLP。 38、治療：一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞，以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法。 39、 反義 RNA：堿基序列正好與有意義的 mRNA 互補(bǔ)的RNA 稱為反義 RNA?？梢宰鳛橐环N調(diào)控特定表達(dá)段。 40、 核酶：是一種可以催化 RNA 切割和RNA 剪接反應(yīng)的由RNA 組成的酶，可以作為表達(dá)和的抑制劑。 41、 三鏈 DNA：當(dāng)某一 DNA 或 RNA 寡核苷酸與 DNA 高嘌呤區(qū)可結(jié)合形成

29、三鏈，能特異地結(jié)合在 DNA 的大溝中，并與富含嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵。 42、 SSCP：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于 DNA 構(gòu)象差別來檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。相同長(zhǎng)度的單鏈 DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。 43、 管家：在生物體生命的全過程都是必須的，且在一個(gè)生物的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的。 44、 細(xì)胞全能性：指同一種生物的所有細(xì)胞都含有相同的DNA，即的數(shù)目和種類是一樣的，但在不同階段，同一的不同組織和中表達(dá)的種類和數(shù)目是不同的。 45、 SD 序列：轉(zhuǎn)錄出的 mRNA要進(jìn)入核糖體上進(jìn)行翻譯，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列與大腸桿菌 16S rRNA

30、3，末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體的識(shí)別位點(diǎn)。 46、 反義核酸技術(shù)：是通過一種短鏈且與 DNA 或 RNA 互補(bǔ)的，以 DNA 或 RNA 為目標(biāo)抑制翻譯的反義分子，干擾目的的轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程的技術(shù)。 47、 核酸探針：探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用，并在相互作用之后可以檢測(cè)出來的生物大分子。核酸探針是指能識(shí)別特異堿基順序的帶有標(biāo)記的一段 DNA 或 RNA 分子。 48、 周期蛋白：是一類呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)、累積與分解的蛋白質(zhì)，它與周期素依賴性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行。 49、 CAP：是大腸桿菌分解代謝物活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號(hào)傳遞個(gè)許多子

31、，使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時(shí)可以利用其他碳源。 50、 順反子 51、 結(jié)構(gòu)域 二、 問答題（一）、原核、真核組的特點(diǎn)？答：1、組的特點(diǎn)： 種類單一；單倍體組：每個(gè)組在中只出現(xiàn)一次；形式多樣；大小不一；動(dòng)物/細(xì)菌病毒與真核/原核相似：內(nèi)含子；具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)；編碼區(qū)無間隔：通過宿主及本身酶切；無帽狀結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)沒有翻譯起始序列。2、原核組的特點(diǎn)： 為一條環(huán)狀雙鏈DNA；只有一個(gè)起點(diǎn)；具有子結(jié)構(gòu)；絕大部分為單拷貝；可表達(dá)約 50%，大于真核生物小于；一般是連續(xù)的，無內(nèi)含子；重復(fù)序列很少。 3、真核組的特點(diǎn)： 真核生物組遠(yuǎn)大于原核生物組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，數(shù)龐大，具有多個(gè)起點(diǎn)；組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)，于細(xì)胞核內(nèi)；真核

32、為反子，而細(xì)菌和的結(jié)構(gòu)多為多順反子；組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)；真核多為不連續(xù)的斷裂，由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌而成；存在大量的重復(fù)序列；功能相關(guān)的各種；存在可移動(dòng)的遺傳；體細(xì)胞為雙倍體，而和為單倍體。（二）、乳糖子的作用機(jī)制？答：1、乳糖子的組成：大腸桿菌乳糖子含 Z、Y、A 三個(gè)結(jié)構(gòu)，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)序列 O，一個(gè)啟動(dòng)子 P 和一個(gè)調(diào)節(jié)I。 2、阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時(shí)，I編碼的阻遏蛋白結(jié)合于序列 O 處，乳糖子處于阻遏狀態(tài)，不能分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于序列，乳糖子被誘導(dǎo)開放分解乳糖的三種酶。所以，

33、乳糖子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。 3、CAP 的正性調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有 CAP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí)，c濃度升高，與 CAP 結(jié)合，使 CAP 發(fā)生變構(gòu)，CAP 結(jié)合于乳糖子啟動(dòng)序列附近的 CAP 結(jié)合位點(diǎn)，激活 RNA 聚合酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖子實(shí)行正調(diào)控，加速分解乳糖的三種酶。 4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖子中的 I編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與 CAP 的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。（三）、真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制？答：真核生物在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過反式作用因子、順式作用元件和 RNA 聚合酶的

34、相互作用來完成的，主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程。 1、 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成：真核生物 RNA 聚合酶識(shí)別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與DNA 形成的蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物，只有當(dāng)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA 上，形成有功能的啟動(dòng)子，才能被 RNA 聚合酶所識(shí)別并結(jié)合。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過：TFD 結(jié)合A 盒；RNA 聚合酶識(shí)別并結(jié)合TNA 復(fù)合物形成一個(gè)閉合的復(fù)合物；其他轉(zhuǎn)錄因子與 RNA 聚合酶結(jié)合形成一個(gè)開放復(fù)合物。在這個(gè)過，反式作用因子的作用是：促進(jìn)或抑制 TFD 與A 盒結(jié)合；促進(jìn)或抑制 RNA 聚合酶與 TNA 復(fù)合物的結(jié)合；促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的

35、形成。 2、 反式作用因子：一般具有三個(gè)功能域（DNA 識(shí)別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白結(jié)合域）；能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件；對(duì)的表達(dá)有正性或負(fù)性調(diào)控作用。3、 轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控： 反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達(dá)式調(diào)節(jié)反式作用因子出來就具有活性；共價(jià)修飾磷酸化和去磷酸化，糖基化；配體結(jié)合許多激素受體是反式作用因子；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離與形成。反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：反式作用因子被激活后，即可識(shí)別并結(jié)合上游啟動(dòng)件和增強(qiáng)子中的保守性序列，對(duì)轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的作用方式成環(huán)、滑動(dòng)、Oozing。 反式作用因子的組合式調(diào)控作用：每一種反式作用

36、因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但反式作用因子對(duì)調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用。（四）、真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制？答：（1）、5，端加帽和 3，端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義：5，端加帽和 3，端多聚腺苷酸化是保持 mRNA 穩(wěn)定的一個(gè)重要，它至少保證 mRNA 在轉(zhuǎn)錄過不被降解。（2）、mRNA 選擇性剪接對(duì)表達(dá)調(diào)控的作用（3）、mRNA的控制（五）、受體的特點(diǎn)？答：1、高度專一性；2、高度親和性；3、可逆性；4、可飽和性；5、特定的作用模式（六）、表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑？答：表皮生長(zhǎng)因子受體是一個(gè)典型的蛋白酪氨酸激酶受體，這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主

37、要步驟是： 1、 受體二聚化的形成及其磷酸化：表皮生長(zhǎng)因子與受體的結(jié)合使受體發(fā)生二聚化，從而改變受體構(gòu)象，使蛋白酪氨酸激酶活性增強(qiáng)，受體自身的幾個(gè)蛋白酪氨酸殘基在激酶的作用下發(fā)生磷酸化。 2、 募集接頭蛋白 Grb2：表皮生長(zhǎng)因子受體自身被磷酸化后，不僅其激酶活性增強(qiáng)，而且其構(gòu)象發(fā)生變化，從而適合與含 SH2 結(jié)構(gòu)域的蛋白分子相結(jié)合。Grb2 是作為接頭蛋白結(jié)合到受體上。 3、調(diào)控分子 SOS 的活化：SOS 含有可與 SH3 結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的富含脯氨酸基序，當(dāng) Grb2結(jié)合到磷酸化的表皮生長(zhǎng)因子受體后，它的兩個(gè) SH3 結(jié)構(gòu)域即可結(jié)合 SOS，使之活化。 4、 低分子量 G 蛋白 Ras 的活

38、化：SOS 可促進(jìn)RasGDP，結(jié)合GTP 的反應(yīng)，使Ras 激活?；罨腞as 作用其下游分子Raf，使之活化。Raf 是 MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一個(gè)分子，由此啟動(dòng)了 MAPK 的三級(jí)激活過程。 5、 MAPK 的級(jí)聯(lián)激活：Raf是一種 MAPKKK，它作用于 MEK，使之磷酸化而激活，活化的 MEK 在作用于 MAPK的 ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三級(jí)激活。 6、 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用：活化的 ERK 可以轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，使某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生磷酸化，從而影響的轉(zhuǎn)錄。（七）、c信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？答：1、組成：胞外信息分子（主要是胰高血糖素、腎上腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素），受體，G

39、 蛋白，AC，c, PKA。 2、途徑： ? 信號(hào)分子與受體結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化 ? 受體活化 G 蛋白 ? 活化后的G 蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶（AC） ? AC 催化ATP 生成 c? c活化 PKA，PKA使目標(biāo)蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)的表達(dá)（八）、IP3-Ca2+信號(hào)途徑：?信號(hào)分子與受體結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化 ? 受體活化G 蛋白 ? 活化后的G 蛋白激活PLC ? PLC 水解PIP2 生成IP3 和DG ? IP3 使鈣通道打開，細(xì)胞內(nèi) Ca2+升高 ? Ca2+與 CaM 結(jié)合，激活 Ca2+-CaM 依賴的蛋白激酶 ? Ca2+-CaM 依賴的蛋白激酶使目標(biāo)蛋白磷酸化

40、。（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？答：（1）、常用的工具酶 1、 限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈 DNA 分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。 2、 DNA 連接酶：將兩段 DNA 分子拼接起來的酶。3、 DNA 聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。 4、 逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄 RNA 成為DNA 的酶，產(chǎn)物 DNA 又稱互補(bǔ) DNA。 5、 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到 DNA 的 3 末端。 6、 堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA 等的 5 磷酸基團(tuán)。 7、 依賴DNA 的 RNA 聚合酶：識(shí)別特異性啟動(dòng)

41、子，RNA 轉(zhuǎn)錄。（2）、良好載體的條件 1、必須有自身的子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA；3、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽性重組子和重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；6、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA 調(diào)控元件。（十）、藍(lán)-選的原理？答：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶片段，在半乳糖苷酶的區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點(diǎn)的 DNA 序列。這些位點(diǎn)上如果沒有克隆外源性 DN段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入 lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶將正常表達(dá)，與

42、大腸桿菌的半乳糖苷酶互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物 X-gal 和誘導(dǎo)劑 IPTG 后，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上外源 DN段，將使 lac Z滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標(biāo)志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。十一）SANGER 雙脫氧鏈終止法的原理？答：DNA 鏈中核苷酸以 3,5-磷酸二酯鍵連接，DNA 所用的底物是 2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP 與普通 dNTP 不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?3位置缺少一個(gè)羥基。在 DNA 聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA 鏈中，但由于沒有 3羥基，不能同后續(xù)的 dNTP 形成磷酸二酯鍵，

43、因此，正在延伸的 DNA鏈不能繼續(xù)延伸。在 DNA反應(yīng)混合物的 4 種普通 dNTP 中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離。在 4 組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用 4 種不同的 ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生 4 組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的 A、C、G 或 T 位置。（十二）、核酸分子雜交的原理？答：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及在復(fù)性過個(gè)分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測(cè)

44、核酸和已知序列。（十三）、影響雜交的？答：1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：核酸濃度越大，復(fù)性速度越快。探針長(zhǎng)度應(yīng)控制在 50-300個(gè)堿基對(duì)為好。 2、溫度：溫度過高不利于復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較 TM 值低 25 度。 3、離子強(qiáng)度：在低離子強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強(qiáng)度的增加，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度。 4、雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的 TM 值。它有以下優(yōu)點(diǎn)：在低溫下探針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。 5、核酸分

45、子的復(fù)雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長(zhǎng)度。兩個(gè)不同組DNA 變性后的相對(duì)雜交速率取決于樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)的相對(duì)復(fù)雜性（即 DNA 中的堿基數(shù)）。 6、非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前應(yīng)對(duì)非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作用。（十四）、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)？答：1、cDNA探針：通過逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使 cDNA 得到大量的擴(kuò)增。提取質(zhì)粒后分離純化作為探針使用。它是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。 2、組探針：從組文庫里篩選得到一個(gè)特定的或片段的克隆后，大量擴(kuò)增、純化，切取片段，分離純化為探針。 3、寡核苷酸探針：根據(jù)已

46、知的核酸順序，采用 DNA儀一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段作為探針。 4、RNA 探針：采用克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA 或反義RNA 作為探針。（十五）、探針的標(biāo)記法？答：1、缺口平移法：此法是利用適當(dāng)濃度的 DNase 在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產(chǎn)生一個(gè) 5 末端和 3 末端，3 末端就可以作為引物，在大腸桿菌 DNA 聚合酶的催化下，以互補(bǔ)的 DNA 單鏈為摸板，依次將 dNTP 連接到切口的 3 末端的羥基上，新的 DNA 單鏈；同時(shí) DNA 聚合酶的 53 的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從 5 末端逐步切除，新鏈不斷延伸，從而使原 DNA 分子上的部分核苷酸殘基被

47、標(biāo)記的核苷酸所取代。 2、隨機(jī)引物法：隨機(jī)引物是人工的長(zhǎng)度為 6 個(gè)寡核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物。對(duì)于任何一個(gè)用作探針的 DN段，隨機(jī)引物混合物中都會(huì)有一些六核苷酸片段可以與之結(jié)合，起到 DNA引物的作用。將這些引物與變性的 DNA 單鏈結(jié)合后，以 4 種dNTP（其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的 dNTP）為底物，與探針DNA 互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的 DNA 探針。 3、PCR 標(biāo)記法：在 PCR 反應(yīng)底物中，將一種 dNTP 換成標(biāo)記物標(biāo)記的 dNTP， 這樣標(biāo)記的 dNTP 就在 PCR 反應(yīng)的同時(shí)摻入到新的 DNA 鏈上。 4、末端標(biāo)記法：只是將 DN段的一端進(jìn)行標(biāo)記。（十六）、PCR 的

48、基本原理？答：PCR 是在試管中進(jìn)行的 DNA反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi) DNA 半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外 DNA 分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈 DNA 變成單鏈，單鏈 DNA 與人工的引物退火，然后耐熱 DNA 聚合酶以 dNTP 為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR 全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進(jìn)行 DNA 模板解鏈、引物與模板DNA 結(jié)合、DNA 聚合酶催化新生 DNA 的，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸個(gè)步驟PCR 反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的 DNA 得以迅速擴(kuò)增。DNA 模板

49、變性：模板雙鏈 DNA?單鏈 DNA，94。退火：引物單鏈DNA?雜交鏈，引物的 Tm 值。引物的延伸：溫度至 70 左右， Taq DNA聚合酶以種 dNTP 為原料，以目的DNA 為模板，催化以引物末端為起點(diǎn)的 53DNA 鏈延伸反應(yīng)，形成新生 DNA 鏈。新的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板 PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的 DNA 得到高效快速擴(kuò)增。（十七）、PCR 引物設(shè)計(jì)的基本要求？答：1、引物長(zhǎng)度一般為 1530 個(gè)核苷酸。過短影響 PCR 的特異性，過長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過 TaqDNA 聚合酶最適溫度 74,影響產(chǎn)物的生成。 2、引物的堿基盡可能

50、隨機(jī)，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。3端不應(yīng)有連續(xù) 3 個(gè) G 和 C。否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對(duì)。G+C含量一般占 45 -55。3端和 5端引物具有相似的 Tm 值,Tm 值計(jì)算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T) 3、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過 3bp。 4、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)。 5、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過 70，引物 3末端連續(xù) 8 個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6、引物 3端堿基是延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板 DNA 配對(duì)。引物 3端最佳堿基選擇是

51、G 和 C，形成的堿基配對(duì)比較穩(wěn)定。 7、引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的 5端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行。 8、引物的 5端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始子、終止子等（十八）、PCR 的反應(yīng)條件？答：1、PCR 反應(yīng)的緩沖液： ? Tris-HCl 緩沖液 ? KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會(huì)抑制 Taq DNA 聚合酶活性。 ? 加入 BSA 或明膠有利于保護(hù) TaqDNA 聚合酶活性。 ? 必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高 PCR 反應(yīng)特異性。 2、鎂離子濃度 一般

52、用量 1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA 聚合酶活性需要 Mg 2+。Mg 2+濃度過低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg 2+濃度還會(huì)影響引物的退火、模板與 PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。3、底物濃度 工作濃度 20-200umol/L， dNTPs 濃度過高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。在PCR 反應(yīng)中，4 種 dNTP 必須以等摩爾濃度配制，以減少 PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。 4、Taq DNA 聚合酶 75-80時(shí)具有最高的聚合酶活性，150 個(gè)核

53、苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95仍有活性，應(yīng)用濃度一般為 1-2.5u/100ul 反應(yīng)體積。 5、引物 0.1-0.5umol/L。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增、生成引物二聚體，使目的 DN段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物 Tm 值有關(guān)，引物 Tm 值在55-80 范圍較為理想。 6、反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源表達(dá)的？答：1、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱；2、的劑量；3、影響RNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的：SD 序列、mRNA；4、外源子的選擇；5、表達(dá)產(chǎn)物的大??；6、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。（二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源必須具備的條件？答：1、要求外源的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子； 2、表達(dá)的外源

54、片段要位于大腸桿菌啟動(dòng)子的下游，并形成正確的閱讀框架；3、轉(zhuǎn)錄出的 mRNA 必須有與大腸桿菌 16S rRNA3，末端相匹配的 SD 序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。 4、蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解，且對(duì)宿主無害。（二十一）、真核細(xì)胞表達(dá)外源的條件？答：1、首先必須具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的功能元件。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件； 2、注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，不同類型的細(xì)胞具有不同的特性； 3、注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。（二十二）、轉(zhuǎn)動(dòng)物的概念、原理及應(yīng)用？答：1、概念：是指用人工方法將外源導(dǎo)入或整合到組內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物。它的特點(diǎn)

55、是“分子及細(xì)胞水平操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)”。 2、基本原理：將目的或組片段用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的整合到組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的或中，使其發(fā)育成攜帶有外源的轉(zhuǎn)動(dòng)物，人們可以通過分析轉(zhuǎn)和動(dòng)物表型的關(guān)系，揭示外源的功能；也可以通過轉(zhuǎn)入外源培育優(yōu)良的動(dòng)物品種。 3、應(yīng)用：建立用于研究外源基因表達(dá)調(diào)控體系；建立醫(yī)學(xué)中常用的疾病模型；培育動(dòng)物新品種；藥理學(xué)和藥用蛋白的生產(chǎn)研究。（二十三）、敲除的基本程序？答：通過 DNA 同源重組，使得胚胎干細(xì)胞特定的內(nèi)源被破壞而造成功能喪失，然后通過胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)得到該喪失的小鼠模型的過程稱為敲除

56、。 1、 打靶載體的構(gòu)建：同源序列要足夠長(zhǎng)，要含有篩選用的標(biāo)志。 2、 胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 3、 打靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞 4、 同源重組胚胎干細(xì)胞的篩選 5、敲除胚胎干細(xì)胞注射入胚泡 6、 胚泡植入假孕小鼠的中 7、 雜交育種獲得純合的敲除動(dòng)物（二十四）、DNA 芯片的原理？答：DNA技術(shù)就是一種大規(guī)模的集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針，檢測(cè)樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性定量分析得出待測(cè)樣品的序列及表達(dá)的信息。其方法包括的、樣品的準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分子。（二十五）、誘變劑的作用機(jī)制？答：1、堿基的類似物誘發(fā)突變 2、改變 DNA 的化學(xué)結(jié)構(gòu) 3、結(jié)合

57、到 DNA 分子上誘發(fā)移碼突變 4、紫外線及其他射線引起的 DNA 分子的變化（二十六）、突變類型及其遺傳效應(yīng)？答：1、突變類型： 點(diǎn)突變：DNA 大分子上一個(gè)堿基的變異。分為轉(zhuǎn)換和顛換。 缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從 DNA 大分子上。 ：一個(gè)原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈到 DNA 大分子中間。 倒位：DNA 鏈內(nèi)重組，使其中一段方向倒置。 2、突變的遺傳效應(yīng)： 遺傳的改變：錯(cuò)義突變、無義突變、同義突變、移碼突變 對(duì) mRNA 剪接的影響：一是使原來的剪接位點(diǎn)；二是產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)。 蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：（二十七）、治療的策略？答：1、置換或稱矯正：特定的目的導(dǎo)入特定的細(xì)胞，

58、通過定位重組，讓導(dǎo)入的正常置換組內(nèi)原有的缺陷，不涉及組的任何改變。分子生物學(xué)試題及一、1 cDNA 與 cccDNA： cDNA 是由 mRNA 通過反轉(zhuǎn)錄酶的雙鏈DNA ；cccDNA 是游離 于之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形 DNA 。2 標(biāo)準(zhǔn)折疊：蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元螺旋與折疊通過各種連接多肽可以組成特殊幾何排列的結(jié)構(gòu)塊，此種確定的折疊類型通常稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。幾乎所有的三級(jí)結(jié)構(gòu)都可以 用這些 折疊類型， 乃至他們 的組合型 來予 以 描述 ， 因 此 又將其 稱為標(biāo)準(zhǔn)折疊。 3 CAP ：環(huán) 腺苷酸（ c）受 體蛋白 CRP （ creceptor protein ） ，c與 CRP 結(jié)合 后 所

59、形成的 復(fù) 合物稱 激活 蛋白 CAP （ cactivatedprotein ）4 回文序 列： DN段上 的一 段 所 具 有的反 向互補(bǔ)序 列，常是限制性 酶 切位 點(diǎn) 。 5 micRNA ： 互補(bǔ)干擾 RNA 或 稱反 義 RNA ，與 mRNA序 列 互補(bǔ) ，可 抑制 mRNA 的 翻譯 。 6 核 酶： 具 有 催化活性 的 RNA ， 在 RNA 的 剪 接加工 過起到自我催化 的 作用 。 7 模 體：蛋白質(zhì)分子 空間 結(jié)構(gòu) 中存在著某些形 狀和拓?fù)?結(jié)構(gòu) 頗 為類 似 的 局部區(qū)域 8 信號(hào) 肽： 在 蛋白質(zhì)過 程中 N 端 有 1536 個(gè)氨基酸殘基 的肽 段 ， 引導(dǎo)

60、蛋白質(zhì)的 跨膜 。 9 弱化 子： 在區(qū) 與結(jié)構(gòu)之 間 的一 段可以 終止 轉(zhuǎn)錄 作用 的 核苷酸序 列。10 魔斑 ： 當(dāng)細(xì)菌 生 長(zhǎng) 過， 遇 到氨基酸 全面缺乏時(shí) ， 細(xì)菌 將 會(huì)產(chǎn)生一個(gè) 應(yīng)急 反 應(yīng) ， 停 止 全 部的 表達(dá) 。 產(chǎn) 生 這 一 應(yīng)急 反 應(yīng) 的 信號(hào)是鳥苷 四磷 酸 (ppGpp) 和 鳥 苷五磷 酸（ pppGpp ） 。 PpGpp 與 pppGpp 的作用不只 是一 個(gè)或幾 個(gè)子，而 是 影響 一 大批 ，所以稱 他們 是超級(jí) 調(diào) 控子或稱為 魔斑 。11 上 游 啟動(dòng)件 ：是 指對(duì)啟動(dòng) 子的 活性起到 一種 調(diào)節(jié) 作用 的 DNA序列， -10 區(qū) 的A