同濟醫(yī)院檢驗科ISO15189體系文件04可提取核抗原抗體譜（ENA）測定

1、同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院檢驗科免疫組項目操作指導(dǎo)書TJYYJYKMY/XMZ704第2版標題：可提取核抗原抗體譜（ENA）測定第7章 第04號第 PAGE 4 頁 共 NUMPAGES 4 頁1. 目的：檢測血清標本中的ENA。2. 適用范圍：同濟醫(yī)院檢驗科免疫室。3. 項目名稱：ENA測定。4. 檢測方法：免疫印跡法。5. 檢測原理：在載片上的每個反應(yīng)區(qū)內(nèi)固定了2條免疫印跡膜條。膜條上包被了經(jīng)親和層析純化了的抗原平行線。第一步反應(yīng)，已稀釋的病人標本與膜條溫育。如果是陽性標本，特異性的ENA抗體將與相應(yīng)抗原位點結(jié)合。用酶標記的抗人IgG（酶結(jié)合物）進行第二步溫育與之反應(yīng)，然后加入酶底物以呈顏色反應(yīng)

2、。6. 試劑：6.1 品牌:購自由德國歐蒙公司。6.2 內(nèi)含物：每一試劑盒組成為：6.2.1 已被抗原的反應(yīng)膜條：10張載片；6.2.2 陽性對照血清：l0.2ml；6.2.3 陰性對照血清：l0.2ml；6.2.4 酶結(jié)合物：l0.5ml；6.2.5 標本緩沖液：160ml；6.2.6 底物液：l4ml；6.2.7 清洗緩沖液：2100ml；6.2.8 說明書:1份7. 儀器品牌、型號：上海鉑斯德牌搖床。8 操作步驟：8.1 打印工作單:8.1.1 打開電腦及打印機電源，8.1.2 雙擊齊效檢驗系統(tǒng)，登陸工號與密碼；8.1.3 雙擊報告處理，單擊標本申請信息，打開標本申請明細信息查詢，打開左

3、上角的所有信息，選擇未生成報告信息。8.1.4 在檢驗項目處選擇ENA執(zhí)行查詢，點擊打印申請單，打印出工作單。8.2 排列被檢測標本:根據(jù)工作單上的庫位號找出相應(yīng)標本，并按工作單上的順序排列。8.3 按以下步驟開始操作:8.3.1 準備試劑和血清標本：8.3.1.1 在使用前，所有試劑及載片應(yīng)達室溫。8.3.1.2 載片:直接使用。與室溫平衡后方可打開保護膜，以防止包被面發(fā)生冷凝。8.3.1.3 陽性和陰性對照血清:直接使用。8.3.1.4 酶結(jié)合物：用清潔的吸管取所需量并用標本緩沖被1:10稀釋。例如，吸取30ul酶結(jié)合物加到270ul標本稀釋液中。8.3.1.5 標本緩沖液:1瓶60ml，

4、直接使用。8.3.1.6 濃縮清洗緩沖液，10倍濃度。用清潔的吸管吸取所需量并用蒸餾水1:10稀釋。8.3.1.7 底物液:直接使用。因?qū)饷舾?，在使用之前?yīng)立即蓋緊瓶蓋避光存放。8.3.2 稀釋血清或血漿標本：血清或血漿標本用標本緩沖液1:101稀釋。8.3.3 加樣，將加樣板放在泡沫塑料板上，加50ul己稀釋血清于加樣板的每個反應(yīng)區(qū)。避免產(chǎn)生氣泡。8.3.4 溫育(1)將載片蓋在加樣板的凹槽里，反應(yīng)開始。確保每個標本均與載片上的膜條接觸，在300rpm搖床上室溫溫育30分鐘。8.3.5 清洗:將清洗緩沖液盛于燒杯中，滴水沖洗載片后，放在小杯玻璃框里浸洗 15分鐘。8.3.6 加樣:加50u

5、l己1:101稀釋的酶結(jié)合物(堿性磷酸酶標記的抗人IgG于加樣板的每個反應(yīng)區(qū)。8.3.7 溫育：將載片從清洗緩沖液中取出，只需擦干背部和四周后置于加樣凹槽里。在300rpm搖床上室溫溫育30分鐘。8.3.8 清洗:將緩沖液盛于燒杯中，流水沖洗載片后立即放在小杯的玻璃框里浸洗15分鐘。8.3.9 加50ul底物液于加樣板的每個反應(yīng)區(qū)。8.3.10 溫育：將載玻片從清洗緩沖液中取出，擦千背部及底邊后置于加樣板的凹槽里。8.3.11 清洗:用去離子水或蒸餾水沖洗載片。風(fēng)干數(shù)分鐘。8.4 結(jié)果：根據(jù)膜條上顏色強度判斷結(jié)果。與非抗原包被相比，陽性反應(yīng)將在相應(yīng)的抗原處可見蘭/紫色條帶?？谷薼gG帶(右側(cè)條

6、膜底部)出現(xiàn)清析陽性反應(yīng)說明實驗操作正確，若抗人IgG條帶出現(xiàn)微弱反應(yīng)，需要重復(fù)實驗。8.5 發(fā)送報告：詳見免疫報告發(fā)送程序。9. 參考范圍：正常人陰性。10. 臨床意義:10.1 高滴度的IU-nRNP抗體是混合性結(jié)締組織病(MCTD，Sharp綜合征)的特征，發(fā)生率為95%100%，抗體滴度與疾病活動性相關(guān)。UI-nRNP抗體在30%-40%的系統(tǒng)性紅狼瘡患者也可見。10.2 Sm抗體與系統(tǒng)性紅班狼瘡密切相關(guān)，與dS-DNA一起，是系統(tǒng)性紅班狠瘡的特異性指標，但僅有20%-40%病人樣陽性。10.3 SS-A抗體與各類自身免疫病相關(guān)，常見于干燥綜合癥病人(40%-80%)，也見于系統(tǒng)性紅斑

7、狼瘡(30%-40%)，原發(fā)性膽汁性肝硬化(20%)，偶見于慢性活動性肝炎。此外，100%新生兒紅斑狼瘡出現(xiàn)SS-A抗休。10.4 抗SS -B抗體見于干燥綜合癥(40%-80%)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (10%-20%.)患者，幾乎均為女性(29:l)。干燥綜合癥常同時有SS-A抗體和SS-B抗體。10.5 Scl-70抗休見于25%-75%的進行件系統(tǒng)性硬化癥。10.6 Jo-1抗體見于多肌炎，發(fā)生率為25%-35%。常與肺間質(zhì)纖維化相關(guān)。11 病人準備、標本要求：標本為血清時最好空腹采血，脂血、溶血不可使用。其它體液標本無特殊要求。12 注意事項：12.1 接受標本后不能及時檢測者應(yīng)分離血清時，防止溶血。12.2 試劑盒中的所有組分都應(yīng)當(dāng)作潛在性