高級(jí)生化實(shí)驗(yàn)sds-page

1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一、原理天然蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)的遷移率主要取決于所帶電荷的多少、分子量的大小以及分子的形狀等 。1967 年Shapiro 等人發(fā)現(xiàn)，在有陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡(jiǎn)稱 SDS）存在時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率則主要取決于它的分子量的大小，而與其所帶電荷的多少以及形態(tài)無關(guān)。1969 年 Weber 和 Osborn 用此法測(cè)定出了約 40 種蛋白質(zhì)的遷移率，結(jié)果證明，蛋白質(zhì)的遷移率和其分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系：1gMW= -bm +k式中：MW 為分子量；m 為遷移率；b 為斜率；k 為常數(shù)實(shí)驗(yàn)證明，分子量在 12

2、 000200 000 之間的蛋白質(zhì)，用此法測(cè)驗(yàn)得的分子量，與用其它方法測(cè)得的相比，誤差一般在10%以內(nèi)，重復(fù)性高。此方法還具有設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品用量甚微，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為測(cè)定某些蛋白質(zhì)分子量的常用方法。應(yīng)用此法測(cè)分子量，是將幾種已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行 SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得各樣品的相對(duì)遷移率。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖 7-1）。（若以普通坐標(biāo)紙作圖，則縱坐標(biāo)應(yīng)取蛋白分子量的對(duì)數(shù)值。）然后根據(jù)待測(cè)樣品的相對(duì)遷移率，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其分子量。加入含有巰基乙醇的 SDS 后，巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子

3、中的二硫鍵，而 SDS 能打開蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)變性為松散的線狀。同時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能按每個(gè)氨基酸與固定量的 SDS 結(jié)合（當(dāng)溶液中的 SDS 總量，至少要比蛋白質(zhì)的量高 3 倍，一般是高達(dá)10 倍以上時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS 按1：1.4（W/W）的比例結(jié)合，形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，其結(jié)果：由于 SDS 帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷，所以使 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶上了相同密度的負(fù)電荷，其電量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，基本掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別；SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，改變了蛋白質(zhì)的原有的構(gòu)象，使所有蛋白質(zhì)水溶液中的形狀都近似長(zhǎng)橢圓柱形。不同 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的短

4、軸直徑都一樣，約為 18，而長(zhǎng)軸則與蛋白質(zhì)分子的大小成正比。這樣 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率就不再受蛋白質(zhì)原有電荷及其形狀的影響了，而只取決于橢圓柱的長(zhǎng)度，也就是蛋白質(zhì)分子量的大小。不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠適用于不同范圍的蛋白質(zhì)分子量大小的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇使用分子量與待測(cè)樣品分子量大小相近似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品，從而使待測(cè)樣品的分子量恰好處在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的范圍之內(nèi)。此法雖然適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定，但對(duì)于一些蛋白質(zhì)，如帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）、結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，由于不能定量地與 SDS 相結(jié)合，因而圖 7-1測(cè)定結(jié)果偏差較大。另外，由亞基（如血紅蛋白）或由兩

5、條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的蛋白質(zhì)，在 SDS 的作用下將解離成亞基或單條肽鏈。其電泳后測(cè)得的只是這些蛋白質(zhì)的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是整個(gè)蛋白質(zhì)的分子量。二、材料、儀器和試劑1材料標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的：本實(shí)驗(yàn)使用低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，按商品說明配制。蛋白質(zhì)名稱分子量磷酸化酶 B9400067000430003000017500牛清蛋白肌動(dòng)蛋白碳酸酐酶煙草花葉外殼蛋白是稱取各種蛋白質(zhì) 0.5mg 放入一個(gè)小試待測(cè)蛋白質(zhì)樣品：固體蛋白質(zhì)樣品的管或 1.5mL 的管中，按 0.5mg/mL 的比例，加入 1 倍稀釋的“2樣品稀釋液”，使之溶解，在沸水浴中加熱 2 分鐘，于-20冰箱中備用。液

6、體狀樣品：如，則取一定量（5l）加入等體積的“2樣品稀釋液”混勻，然后置沸水浴中 2 分鐘，冷卻備用。若待測(cè)蛋白質(zhì)樣品太稀可經(jīng)濃縮后再。好的標(biāo)準(zhǔn)、待測(cè)樣品每次用完后，放入-20冰箱保存。若存放時(shí)間較長(zhǎng)，則使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1 分鐘，但同一樣品重復(fù)處理的次數(shù)不宜過多。2儀器 垂直板電泳槽 燒杯、刻度吸管、滴管3試劑 電泳儀 微量進(jìn)樣注射器 30%Acr.0.8%Bis. (W/V)：30g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉雙丙烯酰胺，溶于 100mL 蒸餾水中，過濾，于 40C 暗處，一月內(nèi)可使用。1mol/L8.8TrisHCl 緩沖液：Tris121g 溶于蒸餾水，用濃 HCl 調(diào)至8.8，以蒸

7、餾水容至 1000mL。1mol/L6.8TrisHCl 緩沖液：Tris121g 溶于蒸餾水，用濃 HCl 調(diào)至6.8，用蒸餾水定容至 1000mL。10%（W/V）SDS。10%（W/V）過硫酸銨（新配制）。TEMED：直接用原液，避免揮發(fā)。電極緩沖液（ 8.3）：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸餾水并定容至1000mL。使用時(shí) 10 倍稀釋。2樣品釋液：SDS 500mg，巰基乙醇 1mL，甘油 3mL，溴酚藍(lán) 4mg，1mol/L6.8TrisHCl 2mL，用蒸餾水溶解并定容至 10mL。-200C，以此液樣品時(shí)，樣固體，應(yīng)稀釋 1 倍使用；樣液體，則加入

8、與樣品等體積的原液混合即可。染色液：考馬斯亮藍(lán) R250 0.5g，甲醇 450mL，冰醋酸 100mL，加水 450mL，溶解后過濾使用。脫色液：醋酸 70mL，甲醇 200mL，加水 1730mL，混勻使用。使用后的脫色液用活性炭吸附后過濾，可以重復(fù)使用。11 1.5%瓊脂：將 1.5g 瓊脂加在 100 蒸餾水中，在水浴鍋或電熱套上熱融解。三、操作步驟1制板SDS聚丙烯酰胺凝膠配制成后，可以注入玻璃管中鑄成柱狀，進(jìn)行圓盤電泳。也可以進(jìn)行垂直板狀電泳，兩種方法均到滿意的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)選用板狀電泳，玻璃板需要潔凈干燥。在無凹槽的玻璃板兩邊各加入一條“封條”（其厚度根據(jù)需要而定）。然后放上帶有凹

9、槽的玻璃板，用將兩塊玻璃板垂直放在一個(gè)高 2cm、寬 2cm 比玻璃板面長(zhǎng)的一個(gè)小槽內(nèi)，固定在制膠架上（商品電泳槽有配套裝置），沿封條外緣滴下熱融解的 1.5%瓊脂，同時(shí)在玻璃板下面的小槽內(nèi)灌入同樣的瓊脂溶液將其，防止凝膠液滲漏。2分離膠按下表相對(duì)比例配制所需濃度的分離膠。本實(shí)驗(yàn)中分離膠濃度為 10%，凝膠總用量根據(jù)玻璃板的間隙體積而定。將膠液按比例配好、混勻后，迅速注入兩塊玻璃板的間隙中，至膠液面離玻璃板凹槽 3.5cm 左右。然后在膠面上輕輕鋪 1cm 高的水，加水時(shí)通常順玻璃板慢慢加入，勿擾亂膠面。垂直放置膠板于室溫約 2030 分鐘左右使之凝聚。此時(shí)，在凝膠和水之間可以看到很清晰的一條

10、界面。然后吸出膠面上的水。凝膠濃度試劑5%7.5%10%12.5%15%30%Acr.0.8%Bis.（mL）5.011.213.77.511.211.21011.28.70.30.10.22012.511.26.21511.23.71mol/L8.8TrisHCl 緩沖液（mL）H2O（mL） 10% SDS（mL）10%過硫酸銨（mL） TEMED（l）3濃縮膠試劑用量30%Acr.0.8%Bis. (mL)1.671mol/L Tris-HClH2O (mL) 10%SDS (mL)6.8 (mL)1.257.030.10.110.010%過硫酸銨 (mL)TEMED（l）無論使用何種濃

11、度的分離膠，都使用同一種濃縮膠，其用量根據(jù)實(shí)際情況而定，方法按下表相對(duì)比例混合所需溶液，用少量灌入玻璃板間隙中，沖洗分離膠膠面，而后倒出。然后把余下的膠液注入玻璃板間隙，使液面與玻璃板凹槽處平齊，而后“梳子”，在室溫放置 2030 分鐘，濃縮膠即可凝聚。凝聚后，慢慢取出“梳子”，取時(shí)應(yīng)防止把膠孔弄破。取出“梳子”后，在形成的膠孔中加入蒸餾水，沖洗出未凝聚的丙烯酰胺等，倒出孔中水，再加入電極緩沖液。將灌好膠的玻璃板垂直固定在電泳槽上，帶凹槽的玻璃板與電泳槽緊貼在一起，形成一個(gè)貯液槽，向其中加入電極緩沖液，使其與膠孔中的緩沖液相接觸。在電泳槽下端的貯液槽中也加入電極緩沖液。加樣加樣的量應(yīng)適中，樣品

12、中至少含有 0.25g 的蛋白質(zhì)，染色后才能檢測(cè)得出，1.0g 的蛋白質(zhì)則十分明顯。樣品的點(diǎn)樣體積根據(jù)樣品溶液的濃度及凝膠孔的大小，可在 10100l 之間。加樣時(shí)用微量進(jìn)樣器（50100l 體積）吸取已處理好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品 20l（或根據(jù)商品說明加樣）。將進(jìn)樣器針頭穿過凝膠孔上的緩沖液，使樣品落在凝膠面上，推時(shí)要慢，用力過猛會(huì)使樣品擴(kuò)散于緩沖液中。以同樣方法加入 20l 待測(cè)蛋白質(zhì)樣品。為了獲得準(zhǔn)確結(jié)果，每個(gè)樣品應(yīng)做兩個(gè)平行。電泳及結(jié)果測(cè)量將電泳槽及電泳儀相連結(jié)，上槽為負(fù)極，下槽為正極。打開電源開關(guān)，將電壓調(diào)至最大，調(diào)節(jié)電流旋鈕，使每板電流為 25mA 進(jìn)行電泳，直至樣品中遷移至離下端 1

13、cm 時(shí)，停止電泳。取下玻璃板，地把其中一塊玻璃板從凝膠上取下來。在溴酚藍(lán)帶的中線一銅絲（電線內(nèi)的銅芯）以標(biāo)出6染色和脫色的位置。將分離膠部分取下，放在盛有染色液的染色槽中浸泡 2030 分鐘左右。倒去染色液，用蒸餾水漂洗一次，然后加入脫色液，室溫浸泡凝膠或放在搖脫液，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止。振蕩使其脫色，更換幾次洗將膠片放在一塊玻璃板上，測(cè)量分離膠上沿至溴酚藍(lán)帶的距離和蛋白質(zhì)移動(dòng)的距離（分離膠上沿至各蛋白質(zhì)區(qū)帶中線的距離）。四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率作橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量作縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，即一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（也可取蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值用一般坐標(biāo)紙作圖）。測(cè)得待測(cè)

14、蛋白質(zhì)的遷移率后，由標(biāo)準(zhǔn)曲相對(duì)遷移率 =蛋白質(zhì)移動(dòng)的距離移動(dòng)距離線上即可查出其分子量。五、SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量應(yīng)注意的幾個(gè)問題1SDS 的結(jié)合程度根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng) SDS 單體濃度大于 lmmol/L 時(shí)，平均每克蛋白質(zhì)可結(jié)合 1.4gSDS，這個(gè)比率大致相當(dāng)于 1 個(gè) SDS 分子結(jié)合 2 個(gè)氨基酸殘基。如果蛋白質(zhì)SDS 復(fù)合物不能達(dá)到這個(gè)比率并具有相同的構(gòu)象，就很難得到準(zhǔn)確的結(jié)果。影響蛋白質(zhì)與 SDS 結(jié)合的主要有 3 個(gè)：二硫鍵是否完全被還原。只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原后，SDS 才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去并使之具有相同的構(gòu)象。一般以巰基乙醇作還原劑，在某些情況下

15、，還需將所形成的琉基進(jìn)一步烷基化，以免巰基在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體。溶液中的 SDS 濃度。溶液中的 SDS 總量至少要是蛋白質(zhì)總量的 4 倍，低于這個(gè)比例，就可能使電泳遷移率偏低。溶液的離子強(qiáng)度。溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)該較低，最高不得超過 o26，因?yàn)?SDS 在水溶液中是以單體和分子團(tuán)的混合形式而存在的，SDS 結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量?jī)H決定于平衡時(shí) SDS 的單體濃度，而不是SDS 的總濃度，在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS 單體具有較高的平衡濃度。2凝膠的濃度 不同的凝膠濃度適用于不同的分子量范圍。Weber 的實(shí)驗(yàn)，在 5的凝膠中，分子量在 25 000 至 200 000 之間的

16、蛋白質(zhì)，其分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率呈直線關(guān)系；在 10的凝膠中，10 000 至 70 000 分子量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)其分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率呈直線關(guān)系；在 15的凝膠中，10 000 至 50 000 分子量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)其分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率呈直線關(guān)系。以上各種凝膠，其交聯(lián)度皆為 2.6。因此，應(yīng)該根據(jù)所測(cè)的分子量范圍選擇合適的凝膠濃度，并盡可能選擇分子量范圍和性質(zhì)與待測(cè)樣品相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率 mR 最好在 0.20.8 之間均勻分布。在凝膠電泳中，影響遷移率的較多，而在制膠和電泳過程中很難將每次的各項(xiàng)條件控制得完全一致，因此，用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電

17、泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，每次測(cè)定樣品必須同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，不得利用這一次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。多亞基蛋白質(zhì)的分子量 有許多蛋白質(zhì)，例如血紅蛋白、。胰凝乳蛋白酶等，它們是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，在 SDS 和巰基乙醇的作用下解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這樣一類蛋白質(zhì)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法所測(cè)得的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面、更可靠的資料，還必須采用其他方法測(cè)定其分子量和分子中肽鏈的數(shù)目，與 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果相互對(duì)照。特殊蛋白質(zhì)的分子量 并非所有蛋白質(zhì)的分子量都可采用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法來進(jìn)定。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質(zhì)的分子量用這種方法測(cè)定，其結(jié)果是不可靠的。這些蛋白質(zhì)是：電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)(例如某些糖蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白(例如膠原蛋白)等，它們?cè)?SDS 體系中電泳的相對(duì)遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)不呈線性關(guān)系。以組蛋白 F1 為例，它本身帶有大量的正電荷，盡管結(jié)合了正常比例的 SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量應(yīng)為 21 000，而 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)得的結(jié)果卻是 35 000。因此，對(duì)于這類特殊的蛋白質(zhì)在分析其分子量時(shí)要特別。一般至少用兩種方法來測(cè)定未知樣品的分子量，以便相互驗(yàn)證。為了判斷待測(cè)樣品是否可用S