DB32-T 4000-2021牛結核病診斷技術（γ-干擾素體外ELISA法）-（高清現行）

1、ICS11.220CCS B 41DB32江蘇省地方標準DB 32/T 40002021牛結核病診斷技術（-干擾素體外 ELISA 法）Diagnostic Technique for Bovine Tuberculosis by Interferon-gamma ELISA Assay2021 - 02 -03 發(fā)布2021 - 03 -03 實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB32/T 4000-2021 PAGE * ROMAN II目 次前 言范圍1規(guī)范性引用文件1術語和定義1原理2試劑及儀器2檢測方法2質量控制3結果判定4安全措施4附錄A（資料性） 外周抗凝血培養(yǎng)所需材料5附錄B（資料

2、性） 夾心 ELISA 所需試劑和材料6附錄C（資料性） 檢測所需儀器7附錄D（規(guī)范性） 檢測所用試劑的配制8前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由揚州大學提出。本文件由江蘇省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：揚州大學、江蘇省動物疫病預防控制中心。本文件主要起草人：焦新安、陳祥、徐正中、潘志明、陳昌海、殷月蘭。DB32/T 4000-2021 PAGE 6牛結核病診斷技術（-干擾素體外 ELISA 法）范圍本文件規(guī)定了牛結核病診斷技術（-干擾素體外ELISA法）的試劑及儀器、檢測方法、質量控制和結果判定等。本文件

3、適用于牛結核病診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 18645動物結核病診斷技術GB 19489實驗室生物安全通用要求GB/T 32945牛結核病診斷 體外檢測干擾素法術語和定義本文件沒有特別需要界定的術語和定義。原理感染牛分枝桿菌的牛，其T淋巴細胞已被牛分枝桿菌致敏并產生免疫記憶。當體外再次遇到牛分枝桿菌特異性抗原（結核菌素）刺激時，牛外周血中淋巴細胞被激活并大量釋放-干擾素，而未被感染的牛則不會分泌或低水平分泌-干

4、擾素。通過雙單克隆抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性-干擾素濃度水平，即可診斷牛結核病。試劑及儀器試劑外周抗凝血培養(yǎng)所需材料參見附錄A。夾心 ELISA 所需試劑和材料參見附錄 B。儀器檢測所需儀器參見附錄C。檢測方法試劑配制檢測所需試劑的配制見附錄D。樣品采集與處理無菌采集牛尾靜脈血 3 mL4 mL，加入至含肝素鋰或肝素鈉的抗凝血真空管中，輕輕顛倒2 次 3 次使血液和抗凝劑混合均勻。室溫（225）運送至實驗室并在采血后 24 h 內進行培養(yǎng)。分裝前輕輕顛倒抗凝血真空管，充分混勻血液樣品。將抗凝血無菌加入至 48 孔細胞培養(yǎng)板， 每頭?？鼓盅b 3 孔，1.0 mL/孔（可

5、參考表 1）。在每頭牛的 3 孔抗凝血樣品中，分別無菌加入 67 L PBS、67 L 禽型 PPD 溶液和 67 L 牛型 PPD 溶液（可參考表 1），用微量振蕩器低速充分振蕩，使刺激抗原與抗凝血完全混合。蓋上細胞培養(yǎng)板蓋，避免液體揮發(fā)。將含有抗凝血和刺激抗原的 48 孔細胞培養(yǎng)板在 37濕溫培養(yǎng)箱中孵育 16 h24 h。使用移液器小心吸取上層血漿 200 L300 L，轉至 1.5 mL 離心管中。吸取血漿時應盡量避免吸入紅細胞。表 1. 抗凝血樣品和刺激原加入到 48 孔細胞培養(yǎng)板（豎排放置）動物 1PBSA1禽型PPD A2牛型PPD A3PBSA4禽型PPD A5牛型PPD A6

6、動物 2動物 3PBSB1禽型PPD B2牛型PPD B3PBSB4禽型PPD B5牛型PPD B6動物 4動物 5PBS C1禽型PPD C2牛型PPD C3PBS C4禽型PPD C5牛型PPD C6動物 6動物 7PBS D1禽型PPD D2牛型PPD D3PBS D4禽型PPD D5牛型PPD D6動物 8動物 9PBS E1禽型PPD E2牛型PPD E3PBS E4禽型PPD E5牛型PPD E6動物 10動物 11PBS F1禽型PPD F2牛型PPD F3PBS F4禽型PPD F5牛型PPD F6動物 12動物 13PBSG1禽型PPD G2牛型PPD G3PBSG4禽型PP

7、D G5牛型PPD G6動物 14動物 15PBSH1禽型PPD H2牛型PPD H3PBSH4禽型PPD H5牛型PPD H6動物 16酶聯免疫吸附試驗溶解陽性、陰性對照凍干粉，配制 1PBST 洗滌液，按“操作注意事項”平衡其他試劑。取商品化已包被有 -干擾素單克隆抗體的酶標板（根據樣品多少，可拆開分次使用），先加入 50 L 樣品稀釋液至各孔中，再加入 50 L 血漿樣品及陽性對照、陰性對照至各孔中，輕輕振勻孔中樣品， 貼上封板膜，37孵育 2 h。棄去孔內液體。使用 1PBST 洗滌液洗板 5 次，300 L /孔。每次靜置 1 min 后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙上拍干。用酶標抗體

8、稀釋液按 1：100 稀釋酶標抗體（現配現用）。在每孔中加入 100 L 新鮮配制的酶標抗體，貼上封板膜，37孵育 2 h。使用 1PBST 洗滌液洗板 5 次，300 L /孔。每次靜置 1 min 后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙上拍干。每孔加入 100 L 底物顯色液，貼上封板膜，37避光顯色 10 min。按照加入底物顯色液的順序和時間間隔每孔加入 50 L 終止液，15 min 內在酶標儀上測定OD450nm。操作注意事項由于本試驗需要活的淋巴細胞，因此需要使細胞損傷降至最低。任何情況下不應將抗凝血貯存于冰箱中。刺激后的血漿樣品如不直接進行酶聯免疫吸附試驗，血漿可在 28貯存 7 天，

9、在-20可貯存 6 個月。貯存前，每個貯存管必須用合適的蓋子密封。應在樣品架上標記日期、操作者的首字母、管內容物、動物編號和牛群細節(jié)等相關信息。檢測前，樣品應恢復至室溫并充分混勻。除酶標抗體外，試劑盒使用前各組份應平衡至室溫，使用后即放回 28。不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用過程中各試劑組份應避免交叉污染。底物顯色液避免暴露于強光和接觸氧化劑。終止液中含有H2SO4，使用時注意不要接觸到身體和衣物?？贵w包被酶標板拆封后應避免受潮或沾水（每次將剩余的抗體包被酶標板用封口袋扎緊后盡快置于 28）。陽性對照和陰性對照凍干粉用滅菌純水稀釋并使用后，盡快置于 28保存。待檢血漿樣品數量較多時，可

10、先使用樣品稀釋液稀釋完所有待檢血漿，再將稀釋好的血漿轉移到反應板，保證反應時間一致。嚴格按照操作說明書要求進行，操作過程中移液、定時和洗滌等過程應精確。質量控制在判定結果前必須檢查對照樣品的結果，確定陰性對照和陽性對照的OD450nm值在規(guī)定范圍之內： 陰性對照OD450nm值范圍為0.00.15。陽性對照OD450nm值范圍為0.73.0。如果有一條標準不符合，試驗是無效的，應重新進行檢測。結果判定計算每個樣品PBS 刺激組、禽型 PPD 刺激組和牛型 PPD 刺激組的 OD450nm 值。如果做重復孔，應計算每頭牛所有樣品PBS 刺激組、禽型PPD 刺激組和牛型 PPD 刺激組的平均OD4

11、50nm 值。結果判定標準陽性判定標準：牛型PPD 刺激組 OD450nm 值-PBS 刺激組OD450nm 值0.1 且牛型PPD 刺激組 OD450nm值-禽型PPD 刺激組 OD450nm 值0.1。陰性判定標準：牛型 PPD 刺激組 OD450nm 值-PBS 刺激組 OD450nm 值0.1，或牛型 PPD 刺激組OD450nm 值-PBS 刺激組 OD450nm 值0.1 且牛型PPD 刺激組OD450nm 值-禽型PPD 刺激組 OD450nm 值0.1。安全措施按照GB/T 18645和GB 19489執(zhí)行。附 錄 A（資料性）外周抗凝血培養(yǎng)所需材料肝素鋰或肝素鈉真空抗凝管；5

12、 mL 或 10 mL 動物采血器；無菌 48 孔細胞培養(yǎng)板；牛型 PPD 溶液（2.5 mL/瓶）；禽型PPD 溶液（2.5 mL/瓶）；100 L、1000 L 槍頭；用于貯存血漿的 1.5 mL 離心管；96 孔板架。附 錄 B（資料性）夾心ELISA 所需試劑和材料酶標板（包被牛-干擾素單克隆抗體，含 0.1% ProClin 300）；牛 -干擾素陽性對照凍干粉（含 0.1% ProClin 300）；牛 -干擾素陰性對照凍干粉（含 0.1% ProClin 300）；樣品稀釋液（血漿稀釋緩沖液，含 0.1% ProClin 300）；PBST 洗滌液（20）（含 0.1% ProC

13、lin 300）；酶標抗體（含 0.1% ProClin 300）；酶標抗體稀釋液（含 0.01%的硫柳汞）；底物顯色液（TMB（3,3,5,5-四甲基聯苯胺）溶液）；終止液（0.5M H2SO4）；滅菌純水（用于溶解陽性對照、陰性對照凍干粉）；蒸餾水（用于稀釋洗液）；酶聯免疫吸附試驗所需的試劑、反應槽、封板膜和槍頭。DB32/T 4000-2021附 錄 C PAGE 7（資料性） 檢測所需儀器37濕溫培養(yǎng)箱；精密可調移液器（100 L、1000 L）；1 mL、5 mL、10 mL 的移液器；100 mL、1 L、2 L 的量筒；C.512 道移液器（50 L 300 L）；微量振蕩器（可

14、選）；洗板機（可選）；37水浴鍋；酶標儀（含 450nm 濾光片）。DB32/T 4000-2021附 錄 D PAGE 8（規(guī)范性）檢測所用試劑的配制刺激抗原牛型PPD 溶液（10000 IU/mL）和禽型PPD 溶液（7500 IU/mL）在使用前徹底混勻，2.5 mL/瓶。酶標板在開封前將酶標板恢復至室溫，可放置 30 min 以上。陽性對照和陰性對照用 0.2 mL 滅菌純水分別溶解陰、陽性對照凍干粉。應保證完全溶解，溶解的陽性對照、陰性對照在 28可儲存 1 個月，但再次使用前應恢復至室溫并充分混勻。樣品稀釋液恢復至室溫并充分混勻，用作血漿稀釋緩沖液。酶標抗體和酶標抗體稀釋液酶標抗體必須一直保存于 28。酶標抗體稀釋液可直接使用。按表 2