疏水層析填料

1、2008-6Volume8chisSOICellufine疏水層析填料疏水層析，是根據(jù)不同的蛋白與疏水表面產(chǎn)生的相互作用的差異，進(jìn)行蛋白分離的一種方法。-般而言，離子強(qiáng)度（鹽濃度）越高，物質(zhì)所形成的疏水鍵越強(qiáng)。影響疏水作用的因素包括：鹽濃度,溫度，pH,表面活化劑和有機(jī)溶劑。疏水層析的應(yīng)用與離子交換層析的應(yīng)用剛好互補(bǔ)，因此，可以用于分離離子交換層析很難或不能分離的物質(zhì)。Chisso公司生產(chǎn)的疏水層析填料，有三種類型：CellfineTMButyl,Phenyl和Octyl,分別為在多孔的交聯(lián)纖維素顆粒上通過一個(gè)短接頭，共價(jià)鍵和丁基，苯基或者辛基的層析填料。結(jié)構(gòu)見下圖：f)00B-6HCH/廠c

2、h3ButylOrHc-OHCHrOPhenyloB-6HFigure1Variaiuioflit；Hyd-ophcbicDegree填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，CellfineTMOctyl對(duì)疏水性蛋白的吸附性會(huì)強(qiáng)于CellfineTMButyl對(duì)疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厲害，也就越難洗脫。CellfineTMPhenyl，具芳香族物質(zhì)的特性，因此，在某些情況下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物質(zhì)。在使用疏水層析分離物質(zhì)時(shí)，沒有通法，只能根據(jù)待分離物質(zhì)的特性，篩選合適的填料，摸索優(yōu)化其分離純化的條件。三種疏水層析填料的疏水性差異（左圖

3、）色譜柱：8.2x150mm柱體積：8ml流動(dòng)相：2.0-0.0MAmmoniumSulfatein0.01Mphosphate,pH7.0流速：1.32ml/min樣品：5mg/3ml-100卩1H&E北京慧德易科技有限責(zé)任公司2008-6Volume8AsahipakNH2P色譜柱(氨基柱)AsahipakNH2P色譜柱是Shodex公司生產(chǎn)的用于分析糖類物質(zhì)的正相柱oAsahipakNH2P色譜柱，是以聚合物為基材的氨基柱，化學(xué)穩(wěn)定性良好，在pH2-13的條件下均可使用。與硅膠基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱AsahipakNH2P,可以很好地實(shí)現(xiàn)硅膠基材氨基柱的各種應(yīng)用；對(duì)流動(dòng)相的

4、耐受性更好，使用壽命更長久；另外，AsahipakNH2P可用于定量分析；還可以用堿性溶劑沖洗。NH2P-504EAfter180hrs10Firstuse1.Frijclo$2-GlMcase3Sucrose4MaKo&eV(mL)Time(hr)mlnSilicabasedaminocoIumnFirstuseAfter120hrsMaltDMSucre顯FructoseV&lmL)2QM1001M2MTim(hr)聚合物基材氨基柱與硅膠基材氨基柱的柱壽命比較左圖為AsahipakNH2P色譜柱與硅膠基材氨基柱的壽命對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示：隨著使用時(shí)間的延長，硅膠基材氨基柱對(duì)單糖、二糖的保留快

5、速下降，其原因應(yīng)是硅膠基材氨基柱的氨基降解所致。色譜柱：AsahipakNH2P-504E,其它公司的氨基柱(4.6mmID*250mm)流動(dòng)相：CH3CN/H2O=75/25流速：1.0mL/min檢測(cè)器：ShodexRI柱溫:30度AsahipakNH2P色譜柱可在正相模式下分離糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)按照分子量由小到大的順序依次被洗脫。增加洗脫液中有機(jī)溶劑的比例可以延遲糖類的洗脫時(shí)間。AsahipakNH2P色譜柱可以在堿性，室溫條件下分離單糖、二糖和糖醇混合物。右圖為AsahipakNH2P色譜柱分離單糖、二糖及三糖混合物的應(yīng)用實(shí)例。單糖、二糖及三糖混合物的分離色譜柱：ShodexAsahi

6、pakNH2P-504E(4.6mmID*250mm)流動(dòng)相：H2O/CH3CN=25/75流速：1.0mL/min檢測(cè)器：ShodexRISampleiRhamnosebFructosebc.GluconodSucrosee：MsHosef.RaffinosecdDId2030min.柱溫:30度H&E北京慧德易科技有限責(zé)任公司2008-6Volume8學(xué)習(xí)園地導(dǎo)致色譜柱柱壓升高的原因及解決方案第一階段：確認(rèn)是柱子導(dǎo)致的壓力上升，還是HPLC系統(tǒng)導(dǎo)致的壓力上升。由于HPLC系統(tǒng)有很多環(huán)節(jié)，如泵、管路等，都容易吸附和積聚雜質(zhì)，這些因素均會(huì)導(dǎo)致壓力上升，所以，應(yīng)先對(duì)HPLC系統(tǒng)進(jìn)性排查。排查方法

7、：取下色譜柱，僅用管路連接并正常輸送流動(dòng)相時(shí)記錄系統(tǒng)壓力。如果此時(shí)HPLC系統(tǒng)壓力正常，則考慮是柱壓升高。第二階段：確定是否使用了保護(hù)柱（預(yù)柱）。一般在測(cè)定容易堵塞色譜柱的樣品時(shí)，應(yīng)該使用保護(hù)柱。如果使用了保護(hù)柱，那么壓力的升高就有可能是保護(hù)柱的柱壓升高導(dǎo)致的。排查方法：取下色譜柱，僅以保護(hù)柱連接管路并正常輸送流動(dòng)相測(cè)試柱壓，再反過來取下保護(hù)柱僅以色譜柱連接管路正常輸送流動(dòng)相測(cè)試柱壓，如果僅當(dāng)連接保護(hù)柱時(shí)柱壓高的話，則為保護(hù)柱引起的柱壓升高，請(qǐng)清洗、或更換保護(hù)柱。第三階段：如果不是上述第一、第二點(diǎn)原因造成壓力升高，就可以確認(rèn)是色譜柱的原因了。如果柱壓是隨著使用時(shí)間的延長，慢慢上升，這屬于正?，F(xiàn)

8、象，是色譜柱達(dá)到使用壽命了，只能更換色譜柱了。如果柱壓是在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，實(shí)施中或經(jīng)過一次、幾次實(shí)驗(yàn)后，突然上升，則要結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況考慮以下因素：原因解決方案色譜柱柱長色譜柱越長，柱壓越高?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)減小柱長。柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑越小，柱壓越高?？蛇x擇大內(nèi)徑色譜柱。填料基質(zhì)的形態(tài)填料的形態(tài)也會(huì)對(duì)柱壓有影響。硅膠基質(zhì)的形態(tài)可以分為無定形和球形兩種，現(xiàn)在一般裝柱使用球形硅膠。顆粒大小小粒徑填料裝填的色譜柱柱壓較咼，在不影響分離效果的同時(shí)，可選擇大粒徑的填料。填料合成條件及裝柱條件不同廠家生產(chǎn)的色譜柱有的柱壓可能相差4、5個(gè)MPa，特別是低端和高端色譜柱之間，這一區(qū)別比較明顯。例如：YMC公司生產(chǎn)的色譜柱

9、，就屬于高效高壓型的。流動(dòng)相流動(dòng)相的前處理流動(dòng)相中存在的雜質(zhì)也會(huì)堵塞色譜柱，引起柱壓升咼。因此，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行必要的試劑前處理，包括濾膜過濾，用固相萃取方法去除容易吸附于色譜柱填料的強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。流動(dòng)相的種類不同流動(dòng)相，因其理化性質(zhì)差異，產(chǎn)生的柱壓有所差異。例如：乙腈產(chǎn)生的壓力低于甲醇，但兩者的分離效果相似。在某些情況下，可以通過替換流動(dòng)相的種類減小柱壓?；旌狭鲃?dòng)相的比例流動(dòng)相成分間的比例，也可以引起柱壓的差異。如：當(dāng)甲醇/水=50/50時(shí)，柱壓就較高?？梢酝ㄟ^調(diào)整流動(dòng)相成分間的比例降低柱壓。溫度溫度的變化也會(huì)導(dǎo)致柱壓的變化。最好使用柱溫箱控溫，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，適當(dāng)升高柱溫以減小柱壓。樣品含有

10、不溶性成分過濾樣品，充分離心，防止堵塞預(yù)柱及色譜柱，引起柱壓升高。鹽分樣品或緩沖液中的鹽分結(jié)晶于柱內(nèi)，也可引起柱壓升高。如：乙酸銨。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，清洗色譜柱中的鹽分，從而降低柱壓。如:先用4050C的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速?zèng)_洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘。被填料吸附沉積樣品污染沉積也會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。須根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況和柱子類型進(jìn)行清洗。（常規(guī)的清洗方法如下。）常規(guī)的色譜柱清洗方法（正向沖洗）使用比目前使用的流動(dòng)相對(duì)樣品溶解能力更強(qiáng)的試劑清洗色譜柱。如果您使用的流動(dòng)相是乙腈：水（70:30），請(qǐng)使用更高濃度的乙腈水溶液進(jìn)行清洗，比如乙腈：水（80:20）或乙腈：水（90:10）。但是，如果高濃度的乙腈水溶液導(dǎo)致樣品溶解困難的話，請(qǐng)停止使用上述流動(dòng)相，轉(zhuǎn)而使用對(duì)樣品易溶的流動(dòng)相。如果該方法仍不見效，請(qǐng)?jiān)囉孟率龇椒?。色譜柱清洗方法（反向沖洗）將色譜柱反向連接（即與色譜柱上箭頭標(biāo)識(shí)相反的方向使流動(dòng)相由出口處流入、入口處流出）輸送流動(dòng)相試試。此時(shí)，如果柱壓太高會(huì)對(duì)色譜柱造成損壞，所以請(qǐng)將流速調(diào)至平時(shí)操作時(shí)的一半。但是，如果使用相同的流速，反洗比正向清洗柱壓還低的話，可能會(huì)發(fā)生色譜柱入口處的