睪丸皮下埋藏對精子發(fā)生影響的可逆性探討

1、PAGE PAGE 3睪丸皮下埋藏對精子發(fā)生影響的可逆性探討王達利 孫廣峰 魏在榮 崔紅旺 李麗 （遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院燒傷整形外科 遵義563003）摘要：目的 探討新西蘭大白兔睪丸皮下埋藏導致精子發(fā)生障礙后，將埋藏之睪丸放回正常陰囊內(nèi)其精子發(fā)生障礙是否可逆。方法 育齡期雄性新西蘭大白兔42只，曾有過生育史的雌性12只，將雄兔應用隨機數(shù)字表完全隨機法分成3組：空白組（12只）；雙埋組（雙側(cè)睪丸埋藏組12只）；單埋組（單側(cè)睪丸埋藏組18只）。雙埋組將睪丸埋藏于兩側(cè)腹股溝區(qū)皮下；單埋組將一側(cè)睪丸置于腹股溝區(qū)皮下，另一側(cè)睪丸保留在陰囊內(nèi)；空白組不作任何處理。模型成功后第9周空白組、雙埋組、單埋組分別

2、隨機取6只進行睪丸活檢，均行HE染色及采用TUNEL法檢測生精細胞凋亡情況，同時對空白組及雙埋組的剩余6只與分別與雌兔一一配對喂養(yǎng)觀察生育情況。同期將單埋組未取活檢的12只動物的未處理側(cè)睪丸從正常陰囊內(nèi)移出埋藏至同側(cè)腹股溝區(qū)皮下，而將前期埋藏之睪丸放回剛移走睪丸的對側(cè)正常陰囊內(nèi)。單埋組睪丸放回陰囊后第4周及第9周分別對放回陰囊之睪丸取6只取活檢，HE染色及TUNEL法檢測生精細胞凋亡情況。結(jié)果 與空白組相比雙埋組模型建立后第9周的HE染色見曲細精管內(nèi)生精細胞明顯減少，排列紊亂，管腔內(nèi)未見精子；TUNEL法檢測結(jié)果顯示精原細胞也有明顯凋亡征象，生精細胞凋亡指數(shù)（apoptotic index,A

3、I）明顯高于空白組（P0.05）；配對喂養(yǎng)雌兔均無生育，生育率明顯低于空白組（P0.05）。單埋組模型建立后第9周埋藏之睪丸活檢HE染色結(jié)果與雙埋組相似，TUNEL法檢測結(jié)果生精細胞的凋亡指數(shù)與雙埋組相比較差異無統(tǒng)計學意義。埋藏睪丸放回陰囊術(shù)后第9周的HE染色示曲細精管內(nèi)生精細胞層數(shù)增多,可見成熟精子，凋亡指數(shù)與雙埋組比較明顯降低。結(jié)論 睪丸皮下埋藏與皮瓣重建陰囊一樣會導致睪丸精子發(fā)生障礙，但這種損害是可逆的。關(guān)鍵詞: 陰囊 精子發(fā)生 可逆性改變 An Reversibility Study of Burying Testis in Skin Pocket on Spermatogenesis

4、 WANG Dali, SUN Guangfeng,WEI Zai-rong et al. Department of Plastic Abstract：Objective To explore the reversibility of the disturbance effect of the testes were buried in thigh on spermatogenesis in New Zealand white rabbit .Methods 42 male and 12 female New Zealand white rabbits were used as the ex

5、periment animals,The male animals were divided randomly into three groups: normal control group(n=12),bilateral testes buried group(n=12), half testes buried group(n=18). In bilateral testes buried group ,a subcutaneous tunnel was dissected respectively from inner of scrotum to bilateral thigh and t

6、he testis were buried respectively to bilateral thigh. In half testes buried group, only one testis were buried to thigh ;the rabbits in normal control group were not operated. The six testes taken randomly in all groups were biopsyed at 9th week after modeling, then the testiculus were biopsied. An

7、d observed by hematoxylin-eosin staining (HE).To detect the apoptosis spermatogenic cells with TUNEL. The six animals that were not biopsied in the normal control group and the bilateral testes buried group were fed respectively with ones female rabbit to observing the procreation. At the same time

8、, the other testis was buried to thigh in the twelve animals that were not biopsied in the half testes buried group, and the buried testes were put in the normal scrotum. The six testes taken randomly in all groups were biopsyed at 9th week after the buried testes were put in the normal scrotum at 4

9、th and 9th week,And observed by hematoxylin-eosin staining (HE),To detect the apoptosis spermatogenic cells with TUNEL.Results The tier of spermatogenic cells was diminished in the bilateral testes buried groups seminiferous tubule. The spermatogenic cells disposed derangement, the spermatozoa were

10、not seen. The detection of TUNEL method is that the apoptosis of spermatogenous cells was obviously . The bilateral testes buried group apoptotic index was higher than 基金項目：貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項基金項目（2005-65）The Governor special-purpose fund on the talented man in technology and education in GuiZhou provin

11、ce （2005-65） E-Mail:daliwangzythat of the blank group（P0.05）; All the female rabbits pairing with t the bilateral testes buried groups rabbits were not pregnant. The fertility rate was lower than that of the blank group（P0.05）. The result of HE in the half testes buried group is similar to that the

12、bilateral testes buried groups at the 9th week, and the apoptotic index compare to that the bilateral testes buried groups was no significance in statistics. The tier of spermatogenic cells was increased at the 9th week after the buried testes put in the normal scrotum, and the apoptotic index was l

13、ower than that of the bilateral testes buried group. Conclusions The testis were buried in thigh is lead to the disturbance of spermiogenesis likewise the scrotum reconstruction with skin flap, but this damage is reversible.Key Words： Scrotum ；Spermatogenesis ；Reversibility陰囊皮膚損傷若為不全損傷多采用直接縫合的修復方式，但

14、若睪丸完全裸露、陰囊皮膚全部或大部撕脫不能直接縫合閉合創(chuàng)面時修復常比較困難。20世紀5060年代，多采用股部皮袋埋藏睪丸的方法，隨著顯微外科的發(fā)展，近十年來國內(nèi)外多采用皮瓣、甚至肌皮瓣重建陰囊1-3?？紤]到不管是使用皮下埋藏睪丸或是采用皮瓣重建陰囊，睪丸表面的覆蓋物均較正常的陰囊皮膚厚且不具備正常陰囊所特有的局部溫度調(diào)節(jié)作用，因此，這兩種方式修復陰囊皮膚缺損均有可能導致睪丸局部溫度升高而影響睪丸的精子發(fā)生。于是，我們對陰囊皮膚撕脫傷采用皮瓣重建陰囊和股部埋藏睪丸的病人進行了隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)兩種方式修復陰囊均干擾睪丸精子的發(fā)生4。由于考慮是因為重建陰囊之皮瓣較厚、睪丸局部溫度升高導致的精子發(fā)生障礙

15、，我們對一例皮瓣重建陰囊的患者進行了兩次皮瓣修薄手術(shù)，結(jié)果患者的精液質(zhì)量明顯改善，并恢復了生育能力5。因兩種方式修復陰囊皮膚缺損導致精子發(fā)生障礙具有相似性，我們設(shè)計了本實驗模型，以進一步證實我們的前期臨床發(fā)現(xiàn)。1.材料和方法1.1實驗動物 以育齡期新西蘭大白兔( 第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所提供,合格號:scxk渝20020003）為實驗動物, 雄性42只，68月齡，質(zhì)量2.5 2.7 kg，與雌性家兔配對分籠喂養(yǎng)證實其具有生育能力。有過生育史的雌兔12只， 78月齡，質(zhì)量2.5 2.7 kg。雌雄兔分籠喂養(yǎng)1月，確保雌兔未受孕。喂養(yǎng)動物飼料有青草、黃豆粉、麥麩、玉米粉、骨粉、魚粉。喂養(yǎng)期間動物

16、不給任何外加因素的影響。1.2 主要試劑和儀器凋亡檢測試劑盒購于Roche公司；0.01mol/L PH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液（ZLI-9065）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。日本OLYMPUS公司的光學顯微鏡BX-60，德國Leica公司的LeiCa Q570C真色彩圖象分析儀，上海市躍進醫(yī)療器械廠的PYX-DHS37恒溫箱。1.3 實驗動物分組及模型的建立將雄兔應用隨機數(shù)字表完全隨機法分成3組：空白組（12只）、雙埋組（雙側(cè)睪丸埋藏組12只）、單埋組（單側(cè)睪丸埋藏組18只）。雙埋組：手術(shù)切開雙側(cè)陰囊皮膚，解剖游離雙側(cè)睪丸、精索，通過陰囊內(nèi)向兩側(cè)分離皮下隧道至腹股溝區(qū)，將雙側(cè)睪丸分別埋藏

17、于兩側(cè)腹股溝區(qū)皮下，確保睪丸蒂部無扭轉(zhuǎn)后，局部縫合固定防止睪丸回縮，止血后閉合陰囊切口。單埋組：手術(shù)切開右側(cè)陰囊皮膚，解剖游離睪丸、精索，通過陰囊內(nèi)分離皮下隧道至右側(cè)腹股溝區(qū)，將右側(cè)睪丸埋藏于右側(cè)腹股溝區(qū)皮下，確保睪丸蒂部無扭轉(zhuǎn)后，局部縫合固定防止睪丸回縮。左側(cè)陰囊及睪丸不作任何處理?？瞻捉M：12只動物不給任何處理因素。股部埋藏睪丸回放陰囊：在單埋組模型成功后第9周，手術(shù)切開12只動物的左側(cè)陰囊皮膚，解剖游離左側(cè)睪丸及其精索，通過陰囊內(nèi)分離皮下隧道至左側(cè)腹股溝區(qū)，將左側(cè)睪丸埋藏于左側(cè)腹股溝區(qū)皮下，再將右側(cè)埋藏于腹股溝區(qū)皮下的睪丸取出，放入剛?cè)∽咦髠?cè)睪丸的左側(cè)陰囊內(nèi)，確保睪丸無扭轉(zhuǎn)后縫合陰囊皮膚

18、閉合陰囊切口。 1.4 標本采集及制備雙埋組及單埋組模型建立成功后第9周每組隨機抽取6只動物行睪丸活檢（單埋組取埋藏側(cè)睪丸），同期在空白組隨機取6只行睪丸活檢。單埋組睪丸回放陰囊后的第4周、第9周分別隨機取6只行睪丸活檢。常規(guī)石蠟包埋，對所采集的標本進行常規(guī)HE檢測以及生精細胞凋亡檢測。1.5 生精細胞凋亡的檢測（TUNEL法）常規(guī)脫蠟至水；枸櫞酸鈉緩沖液中，700W微波1 min，冷卻至室溫；加Tri-HCL100 l室溫30 min；加50 l TUNEL 反應液37濕盒避光反應60 min；加50 l Concerter-POD37濕盒避光反應30 min；加DAB顯微鏡下控制顯色，蒸餾

19、水終止顯色；蘇木素復染；常規(guī)脫水、透明、烤干、中性樹膠封片。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS) 代替TDT 酶反應液。光鏡下觀察結(jié)果, 細胞核呈棕黃色或棕褐色為陽性。每張切片任選5個生精小管，計數(shù)生精小管中凋亡陽性細胞數(shù)，計算出陽性細胞百分率，求出平均值即是生精細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。1.6配對觀察生育雙埋組模型建立后第9周，將未取睪丸活檢的雙埋組及空白組各6只動物與雌兔同籠配對喂養(yǎng)觀察生育情況。1.7 統(tǒng)計學分析定量資料數(shù)據(jù)均用表示,3組間比較采用單因素方差分析，兩組生育率采用確切概率法分析。2 結(jié)果2.1 HE染色結(jié)果空白組睪丸曲細精管內(nèi)可見各級生精細胞，管腔

20、內(nèi)可見成熟精子。雙側(cè)睪丸埋藏第9周，曲細精管萎縮，管腔空虛，僅見緊貼管壁的單層生精細胞，管腔內(nèi)無成熟精子。單埋組埋藏側(cè)睪丸活檢結(jié)果同雙埋組。單埋組睪丸放回陰囊后第4周睪丸活檢結(jié)果示曲細精管內(nèi)生精細胞數(shù)量及層次增多，但未見成熟精子；第9周見曲細精管內(nèi)生精細胞數(shù)量及層次已基本恢復，接近正常，管腔內(nèi)可見成熟的精子。2.2 TUNEL檢測結(jié)果空白組兔睪丸生精上皮完整， 各級生精細胞及精子排列規(guī)則，少見凋亡的生精細胞， 主要在精母細胞和精子細胞，且陽性較弱（圖1A)。雙埋組及單埋組第9周曲細精管內(nèi)僅見單層生精細胞，且單層生精細胞也有明顯凋亡征象，AI明顯高于空白組（P0.05），雙埋組及單埋組間AI差異

21、無統(tǒng)計學意義（P0.05）。單埋組睪丸放回陰囊后第4周TUNEL檢測生精細胞AI是（32.68.56）% (圖1B)，單埋組睪丸放回陰囊后第9周生精細胞AI是（10.971.16）% (圖1C)，明顯低于第4周時的生精細胞的凋亡指數(shù)，兩時段的生精細胞的凋亡指數(shù)相比較差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）圖1A空白組生精細胞凋亡情況，TUNEL圖1B單側(cè)睪丸埋藏組改建后第4周生精細胞凋亡情況, TUNEL400圖1C單側(cè)睪丸埋藏組改建后第9周生精細胞凋亡情況, TUNEL4002.3配對觀察生育結(jié)果雙埋組模型建立第9周6只動物與雌兔配對喂養(yǎng)后，對應配對的雌兔均未生育；空白組6只與雌兔配對喂養(yǎng)后，對應配

22、對的雌兔均有生育，兩組生育率比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。3 討論溫度作為一種物理因子，可直接干擾睪丸內(nèi)精子的發(fā)生已被研究證實。人類也如大多數(shù)哺乳動物一樣精子發(fā)生與它的微環(huán)境溫度有很大的相關(guān)性，相對低的陰囊溫度是哺乳動物的精子發(fā)生所必需的，精子發(fā)生依賴低于體溫4 5 oC的陰囊溫度6，陰囊皮膚軟組織較薄并具有溫度調(diào)節(jié)作用，這對于維持睪丸的生精功能是十分必要的。有報道指出，睪丸內(nèi)溫度每升高1就會抑制14%的精子生成，表現(xiàn)為精子數(shù)量的減少7。臨床上在對陰囊皮膚缺損進行修復時，必須考慮到修復后睪丸局部的溫度應盡可能的接近正常陰囊的溫度以確保睪丸的生精功 能，遺憾的是這一臨床問題并未受到相關(guān)學者

23、的重視。在過去，對于陰囊皮膚缺損多采用腹股溝區(qū)埋藏睪丸的方式修復，而目前國內(nèi)外普遍采用皮瓣、甚至肌皮瓣修復陰囊皮膚缺損1-3，而極少有學者對皮瓣重建陰囊后是否會干擾睪丸的精子發(fā)生進行相關(guān)研究。我們曾對采用皮瓣重建陰囊及腹股溝區(qū)埋藏睪丸的患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)兩種方式修復陰囊皮膚缺損均會導致睪丸生精功能障礙4。為排除臨床上可能存在的睪丸原發(fā)挫傷、缺血等因素導致的生精功能障礙，我們分別對這兩種方式修復陰囊皮膚缺損進行了實驗研究，結(jié)果也證實對這兩種方式修復陰囊皮膚缺均會導致睪丸的生精功能障礙8,9。鑒于這兩種修復方法睪丸表面的覆蓋物明顯較正常陰囊皮膚厚，而溫度對精子發(fā)生的影響在一定程度上是可逆的，我們設(shè)

24、想是否能夠通過修薄睪丸表面較厚的覆蓋物，降低睪丸局部的溫度，有可能減輕或逆轉(zhuǎn)這兩種修復方式導致的生精功能障礙。為此，我們對前期臨床隨訪研究已經(jīng)證實皮瓣重建陰囊后精子計數(shù)僅4個/HP，且完全為死精子的患者進行了分次陰囊修薄手術(shù)，結(jié)果患者的精液質(zhì)量得到了較好的改善，該患者通過2次陰囊修薄手術(shù)后結(jié)婚順利生育男嬰一名5。由于臨床例數(shù)有限，且兩種方式修復陰囊皮膚缺損導致的生精功能障礙機理是相同的，因此我們設(shè)計了本實驗模型進一步證實我們的臨床發(fā)現(xiàn)。本實驗結(jié)果證實腹股溝區(qū)埋藏睪丸第9周家兔喪失了生育能力，且原因是由于局部溫度升高導致生精細胞過度凋亡所致，將埋藏在皮下之睪丸重新放回正常陰囊后，睪丸的精子發(fā)生逐

25、漸恢復，在放回陰囊后第4周睪丸活檢發(fā)現(xiàn)曲細精管內(nèi)生精上皮的層次已增多，第9周生精上皮的層次已基本恢復正常，管腔內(nèi)已能夠見成熟精子，生精細胞凋亡檢測顯示生精細胞的凋亡指數(shù)也降低，接近正常睪丸水平。此實驗結(jié)果與我們的前期臨床結(jié)果一致，說明睪丸埋藏在皮下或采用皮瓣重建陰囊這種接近于體溫的溫度對精子發(fā)生的影響是可逆的，這一結(jié)論給那些成千上萬的已經(jīng)采用皮瓣重建陰囊或皮下埋藏睪丸修復陰囊皮膚缺損的患者無疑是一個福音。當然，本實驗結(jié)果同時也提示，臨床上最好不要選用睪丸皮下埋藏法和皮瓣修復陰囊皮膚缺損，薄覆蓋如游離植皮修復應優(yōu)先選用，我們近年來對2例全陰囊撕脫傷的患者采用游離植皮修復均取得了滿意的效果。參考文

26、獻1 Ellabban MG,Townsend PL.Single-stage muscle flap reconstruction of major scrotal defects: report of two casesJ.British Journal of Plastic Surgery,2003,56(5):489 -493.2 Kayikcioglu A. A new technique in scrotal reconstruction: short gracilis flapJ. Urology,2003,61(6):1254-1256.3 Castro RB, Oliveira AB,Favorito LA Utilization of skin flap for reconstruction of the genitalia after an electric burnJ. International Braz J Urol., 2006 ,32(1): 68-694 Wang DL,Zheng H,Deng F,et al.Spermatogenesis after scrotal reconstructionJ.British Jou