香蕉枯萎病菌4號小種拮抗細(xì)菌的初步篩選及鑒定

1、香蕉枯萎病菌4號小種拮抗細(xì)菌的初步篩選及鑒定論文摘要：從香蕉根際土中別離得到87株細(xì)菌菌株，采用平板對峙法，篩選出7株對香蕉枯萎病菌4號生理小種具有拮抗作用的菌株，并進(jìn)行了抑制枯萎病菌4號小種菌絲生長和孢子萌發(fā)的試驗(yàn)。結(jié)果顯示，拮抗菌株255、D5、F2、ZK11、214、215、252的發(fā)酵液對香蕉枯萎病菌4號小種菌絲具有顯著抑制效果，在平板上產(chǎn)生的抑菌圈直徑到達(dá)17.90 22.88 mm，并能使病菌菌絲產(chǎn)生畸形或泡囊狀；對孢子萌發(fā)的抑制率到達(dá)64.40% 80.50%。通過對3株抑菌作用不同的拮抗菌株的16S rDNA鑒定和生理生化特性鑒定，結(jié)果顯示，拮抗菌株255、D5和F2分別被初步

2、鑒定為蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis和地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis。論文關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病菌,號小種,拮抗細(xì)菌,基因,鑒定關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病菌；拮抗菌；16SrRNA基因；鑒定香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumfsp.cubense侵染而引起香蕉維管束壞死的一種真菌病害。目前在香蕉枯萎病的防治方面，缺乏有效的化學(xué)防治試劑，農(nóng)業(yè)防治措施也不能到達(dá)較理想的效果。因此，生物防治作為一種經(jīng)濟(jì)、平安、有效的防治措施成為了研究的熱點(diǎn)。目前，對于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集

3、中于香蕉枯萎病拮抗菌的篩選及其室內(nèi)盆栽防治試驗(yàn)。Thangavelu等報道獲得對香蕉枯萎病的防治效果為48%51%的哈茲木霉(Trichodermaharzianum)，獲得防治效果為41%熒光假單孢桿菌Pseudomonasfluorescens能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性抑制香蕉枯萎病，枯草芽孢桿菌也有較好的防效。曹理想等報道，在研究香蕉內(nèi)生菌區(qū)系時，發(fā)現(xiàn)幾株玫瑰淺灰鏈霉菌(Streptomycesroseogriseolus)對香蕉枯萎病菌有一定拮抗作用。本試驗(yàn)旨資助工程：廣東省農(nóng)業(yè)廳(粵農(nóng)函2006-229)在從香蕉根際土壤中篩選出對香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生物防治細(xì)菌菌株，并對其拮抗作用

4、和分類地位進(jìn)行研究，為香蕉枯萎病生物制劑的開發(fā)打下根底。1材料與方法1.1材料1.2方法 孢子萌發(fā)抑制率%= 對照平均孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率 x100 對照平均孢子萌發(fā)率 PCR反響體系50L：TaqTMDNA聚合酶(2U/L)1l，10 xPCR緩沖液含Mg5.0l，dNTPMasterMix(200mol/L)1l，PrimerF(上游引物5pmol/L)1l，PrimerR(下游引物5pmol/L)1l，DNA模板2l，ddHO補(bǔ)足50l。PCR反響條件：95預(yù)變性7min：94變性45s，54退火45s，72延伸90s，循環(huán)30次；72終延10min，4保存。取4lPCR產(chǎn)物用1%

5、瓊脂糖電泳90V/50min檢測，紫外燈下觀察DNA條帶。目標(biāo)片段由上海生物技術(shù)工程測序。測序結(jié)果登陸GenBank，進(jìn)行BLAST比對。從不同香蕉根際土中別離得到細(xì)菌87株，通過與香蕉枯萎病菌的對峙培養(yǎng)45d后，共篩選出對香蕉枯萎病具有抑制作用的細(xì)菌7株，分別是：255、D5、F2、ZK11、214、215、252。在PDA平板實(shí)驗(yàn)中，這7株細(xì)菌能對香蕉枯萎病菌菌絲產(chǎn)生明顯的抑菌作用，靠近拮抗菌一側(cè)的菌絲生長速度變緩或停止，并產(chǎn)生明顯的透明抑菌帶，或者在抑菌帶邊緣產(chǎn)生綠色的色素。表1拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌的平板抑制作用 處理 Treatment 抑菌圈直徑/mm diameter of in

6、hibitive zone/mm 平均值 Average/mm 差異顯著性 different significance 0.05 0.01 255 24 20 22 21.5 22.88 ab* AB D5 19 18.5 18 20 18.00 c BC F2 20 23 24 22 22.25 a A* ZK11 22 23 20 21 21.50 ab AB 214 22 20 19.5 20 20.37 bc ABC 252 24 21 20.5 20 21.38 ab AB 215 18 17.5 18.5 18 17.90 c C 對照 0 0 0 0 0 d D *：同一列中不

7、同字母表示在5%或1%水平存在顯著性差異*:Differentlettersinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceatlevelof5%or1%2.2拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌菌絲的作用方式在抑菌帶交界處挑取局部菌絲塊于顯微鏡下觀察，被拮抗細(xì)菌抑制生長的菌絲主要出現(xiàn)3種不同形態(tài) spores germination rate (%) 平均值 Average 差異顯著性 Different significance 抑制率% Inhibitive rate% 0.05 0.01 255 26.5 23.0 29.0 25.0 25.6 Cd* BC

8、D* 68.0 D5 30.5 39.0 38.5 29.5 34.4 bc B 57.4 F2 14.0 22.5 20.5 21.0 19.1 d D 75.9 214 18.5 26.0 29.5 12.5 21.8 d CD 73.2 215 31.5 29.0 43.0 39.0 35.1 b B 55.9 252 22.5 19.5 19.0 24.5 21.2 d CD 73.5 ZK 31.0 23.0 40.5 34.5 32.2 bc BC 60.1 CK (NB) 73.5 91.5 75.0 83.0 81.7 a A 0.0 *：同一列中不同字母表示在5%或1%水平存

9、在顯著性差異*:Differentlettersinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceatlevelof5%or1%2.4拮抗細(xì)菌的鑒定利用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物對3株抑菌作用不同的拮抗細(xì)菌菌株16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大約1.5kb的特異性條帶。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的模式菌株16SrDNA序列進(jìn)行相似性比擬，結(jié)果顯示，拮抗菌株255的16SrDNA序列長度為1462bp，與芽孢桿菌屬Bacillussp.的序列相似度到達(dá)99%，與蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus同源性到達(dá)99%，與蘇云金芽孢桿菌同源性Bacillusth

10、uringiensis到達(dá)98%；拮抗菌株D5的16SrDNA序列長度為1052bp，與芽孢桿菌屬Bacillussp.相似度到達(dá)99%，與蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis的相似性到達(dá)99%，與蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus同源性也到達(dá)99%；拮抗菌株F2的16SrDNA序列長度為1062bp，與芽孢桿菌屬Bacillussp.的序列相似度到達(dá)99%，與地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis的相似性到達(dá)99%。拮抗菌株F2在營養(yǎng)瓊脂培

11、養(yǎng)基上呈乳白色不透明，外表粗糙皺褶，菌體邊緣不整齊。細(xì)菌菌體呈桿狀，單生，菌體長度約為22.5m，菌體直徑小于1m，可產(chǎn)生近中生的橢圓形芽孢，無伴孢晶體圖2-A；革蘭氏染色陽性，在含葡萄糖或甘露醇的培養(yǎng)基上產(chǎn)酸，淀粉水解呈陽性，能利用檸檬酸鹽，吲哚試驗(yàn)呈陰性表3。A:拮抗菌株F2B:拮抗菌株D5C:拮抗菌株255A:strainF2B:strainD5C:strain255圖2拮抗菌株的芽孢形態(tài)Fig.2sporangiummorphologyofantagonisticbacterium拮抗菌株D5在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈白色，外表無光澤，不透明。菌體呈桿狀，鏈狀排列圖2-B，菌體長度約為34m

12、，直徑約為11.5m；有伴孢晶體，革蘭氏染色陽性，在含葡萄糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)酸，在含甘露醇的培養(yǎng)基上不產(chǎn)酸，淀粉水解呈陽性，能利用檸檬酸鹽，吲哚試驗(yàn)呈陰性(表3。拮抗菌株255在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈乳白色，外表稍有光澤，扁平的圓形菌落。細(xì)菌菌體呈桿狀，鏈狀排列圖2-C，菌體長度為34m，直徑約為11.5m，可產(chǎn)生近中生的芽孢，芽孢略膨大；革蘭氏染色陽性，無伴孢晶體，在含葡萄糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)酸，在含甘露醇的培養(yǎng)基上不產(chǎn)酸，淀粉水解呈陽性，能利用檸檬酸鹽，吲哚試驗(yàn)呈陰性表3。表3拮抗菌株的生理生化特性Tab.3biochemicalcharacteristicofantagonisticbacterium

13、 特征 Character 菌株255 Strain 255 菌株D5 Strain D5 菌株F2 Strain F2 革蘭氏反響 Gram reaction + + + 從D-葡萄糖產(chǎn)酸 Acid production from D-dextrose + - + 從D-甘露醇產(chǎn)酸 Acid production from D-mannitol - - + 利用檸檬酸鹽 Application of citrate + + + 產(chǎn)生吲哚 Production of indole - - - 厭氧生長 Anaerobic + + + 芽孢圓形 Round spore - - - 伴孢晶體 Pa

14、rasporal crystal - - - 淀粉水解 Starch hydrolysis + + + 注：表中+;表示陽性，-;表示陰性通過對拮抗菌F2的16SrDNA序列分析，拮抗菌F2與地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis的相似性到達(dá)99%，再結(jié)合拮抗菌F2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果，參考?伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊?，拮抗菌F2初步鑒定為地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis。通過對拮抗菌D5的16SrDNA序列分析，拮抗菌D5與蠟狀芽孢桿菌Bacillu

15、scereus的相似性為99%，再結(jié)合拮抗菌D5的生理生化特征，拮抗菌D5初步鑒定為蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis。通過對拮抗菌255的16SrDNA序列分析，拮抗菌255與蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus的相似性到達(dá)99%，與蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis的相似性到達(dá)98%，再結(jié)合拮抗菌255的生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定拮抗菌255為蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus。3討論在自然界中，細(xì)菌與真菌之間的拮抗現(xiàn)象普遍存在。利用微生物菌劑來防治植物病害具有高效、經(jīng)濟(jì)、無副作用等優(yōu)點(diǎn)，并且在長期的進(jìn)化過程中，存在于植物根際的微生物與

16、植物之間建立了密切關(guān)系，其中一些細(xì)菌能對病菌產(chǎn)生抑制作用。Pereze-Vicente等獲得對香蕉枯萎病菌抑制效果到達(dá)95%的哈茲木霉Trichodermaharzianum，Ting等還別離到對香蕉枯萎病菌有較強(qiáng)抑制作用的綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、粘質(zhì)沙雷菌Serratiamarcescens、莢殼布克氏菌Burkholderiaglumae。孫正祥等報道其別離的拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病的相對抑制率到達(dá)76%。本試驗(yàn)從香蕉根際土中別離出7株拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌4號小種具有較高的抑制效果，對孢子萌發(fā)的抑制率為64.40%80.50%。另外，還發(fā)現(xiàn)拮抗細(xì)菌能引起香蕉枯萎病

17、菌分生孢子芽管畸形，使病菌菌絲細(xì)胞膨大，細(xì)胞破裂，菌絲體斷裂散生，從而導(dǎo)致枯萎病菌菌絲生長受到抑制，這與肖愛萍等的報道一致。孫正祥等通過對拮抗菌16SrDNA的分析，鑒定其別離的對香蕉枯萎病菌有拮抗作用的菌株為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis。楊秀娟等從果園篩選得到3株對香蕉枯萎病菌有抑制作用的拮抗菌，通過對3株拮抗菌的生理生化反響試驗(yàn)，初步鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌。本試驗(yàn)通過對拮抗菌16SrDNA的序列分析和生理生化特征對拮抗細(xì)菌進(jìn)行鑒定，初步鑒定結(jié)果是：拮抗菌株D5、F2、255分別為蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis、地衣芽孢桿菌Bacilluslichen

18、iformis、蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus。蘇云金芽孢桿菌主要是用于害蟲的防治，也有報道它對植物病原真菌-膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)具有抑制作用，本研究也證實(shí)蘇云金芽孢桿菌對植物病原真菌具有抑制作用，但能否用于大田防治，還有待進(jìn)一步研究。地衣芽孢桿菌對多種植物病原菌具有抑制作用。唐麗娟等報道地衣芽孢桿菌對灰葡萄孢的田間防治效果到達(dá)60%以上，李玉峰等報道地衣芽孢桿菌代謝物對馬鈴薯晚疫病菌具有明顯抑制效果，本研究也證實(shí)地衣芽孢桿菌對香蕉枯萎病菌具有抑制作用。蠟狀芽孢桿菌對植物病原菌具有抑制效果的報道較少。但陳沖等報道蠟狀芽孢桿菌可抑制白

19、粉病的定殖，從而到達(dá)防治白粉病的效果；李柏青等報道將蠟狀芽孢桿菌與青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株進(jìn)行共同培養(yǎng)后，青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株喪失致病力。本研究證實(shí)蠟狀芽孢桿菌對香蕉枯萎病菌具有抑制作用，但能否應(yīng)用于生產(chǎn)，還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中拮抗菌的鑒定僅是通過拮抗菌的16SrDNA序列和生理生化反響進(jìn)行的初步鑒定，仍需利用分子雜交方法對拮抗菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。參考文獻(xiàn)1 Thandavelu R,Palaniswami A,Doraiswamy S, et a1. The effect of Pseudomonas flourascens andFusarium oxysporum f.sp. cu

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