龍眼LEAFY同源基因啟動子的克隆與序列分析

1、龍眼LEAFY同源基因啟動子的克隆與序列分析論文摘要：為了解龍眼LEAFY同源基因LLFY的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，本研究應(yīng)用染色體步移方法克隆了809bp 的LLFY啟動子序列。用在線軟件PlantCARE分析說明，該序列除含有啟動子根本元件，如TATA-BOX、CAAT-BOX外，還含有參與生理周期調(diào)控、干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點、ABA響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件等一些其他的調(diào)控序列，推測LLFY的表達(dá)受生理周期、干旱、光照等的調(diào)控。用 FootPrinter在線工具對龍眼等6個物種的 LEAFY同源基因啟動子進行比擬, 發(fā)現(xiàn)不同植物的啟動子具有保守性, 也存在差異, 說明LEAFY同源基因功能上的分化，LL

2、FY基因具有多種功能。論文關(guān)鍵詞：龍眼,同源基因,啟動子,序列分析LEAFYLFY基因是擬南芥中的花分生組織特性基因，在營養(yǎng)生長向生殖生殖轉(zhuǎn)變過程起主要的調(diào)控作用，被認(rèn)為結(jié)合了內(nèi)外開花的誘導(dǎo)因素，是啟動開花的樞紐。目前擬南芥中LFY的表達(dá)調(diào)控主要有長日照誘導(dǎo)、GA誘導(dǎo)、低溫春化以及自動途徑等四條途徑，LFY的表達(dá)還受microRNA作用的調(diào)控因子SPL3的直接調(diào)控。木本植物的成花誘導(dǎo)與草本植物存在差異，對木本植物L(fēng)FY同源基因表達(dá)調(diào)控的了解還十分有限。對不同物種LFY同源基因的研究說明，LFY同源基因作為花分生組織特性基因的功能是保守的，但在功能上出現(xiàn)分化?；虻膯幼有蛄信c基因的表達(dá)調(diào)控密切

3、相關(guān)，研究說明具有MADS結(jié)構(gòu)域的調(diào)控因子SOC1直接與LFY的啟動子結(jié)合調(diào)控LFY的表達(dá)，結(jié)合部位在LFY啟動子的近端和遠(yuǎn)端兩個位置，這兩個位置含有CArG盒其中心序列為CCWGG。研究結(jié)果還顯示同時與LFY啟動子結(jié)合的還有調(diào)控因子AGL24，AGL24與SOC1結(jié)合在同一位置，SOC1的結(jié)合需要AGL24的配合。此外，LFY啟動子的近端區(qū)域被認(rèn)為含有應(yīng)答GA的順式作用元件。宗成文等別離了葡萄LFY基因的啟動子片段，對序列進行分析并與擬南芥、煙草等LFY基因的啟動子進行比擬，結(jié)果說明LFY同源基因啟動子中轉(zhuǎn)錄元件是相對保守的，但也存在差異。龍眼(DimocarpuslonganL.)是重要的

4、亞熱帶果樹，生產(chǎn)上存在大小年結(jié)果;和沖梢;等問題，都與花芽分化密切相關(guān)。研究說明，龍眼LFY同源基因LLFY的功能與龍眼花序的分化和維持有關(guān)，在沖梢;過程LLFY表達(dá)量下降，LLFY在葉芽中也有微弱表達(dá)。為進一步了解LLFY的功能和表達(dá)調(diào)控規(guī)律，本研究克隆LLFY上游的啟動子序列并進行序列分析，為說明龍眼花芽分化的分子機制提供依據(jù)。1材料與方法1.1試驗材料試材為紅核子龍眼成年樹幼嫩葉片，取材自福建農(nóng)林大學(xué)校園。1.2龍眼葉片基因組DNA的提取龍眼葉片基因組DNA的提取參照曾黎輝等的方法。1.3染色體步移克隆LLFY5端啟動子序列染色體步移使用TaKaRa公司的LAPCRinvitroClon

5、ingKit。首先，對已獲得的LLFY基因組DNA序列進行分析，選用XbaI對龍眼基因組DNA進行酶切，然后與試劑盒提供的相匹配的接頭連接；試劑盒提供相應(yīng)的兩條接頭引物F1、F2，根據(jù)的LLFY序列設(shè)計兩條3端引物R1和R2，R1：GGCAGCAGAGAGATGTAGGTTTGCTAT，R2：GCTGCTGTTTCTGTGTTCACGATACTG；以加接頭的酶切產(chǎn)物為模板，進行兩輪PCR擴增；第一輪PCR擴增條件為：94預(yù)變性3min，94變性30s，56退火2min，72延伸2min，35個循環(huán)，72延伸7min；第二輪PCR擴增條件為：94預(yù)變性3min，94變性30s，60退火2min，

6、72延伸2min，35個循環(huán)，72延伸7min；將獲得的片段回收、純化，與PMD18-TVector購自TaKaRa公司連接，轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選后測序委托上海博亞英駿生物技術(shù)測序。1.4序列分析用DNAMAN軟件拼接序列。應(yīng)用在線軟件PlantCARE對LLFY啟動子序列進行轉(zhuǎn)錄元件分析，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcriptionfactor-bindingsites,TFBS)。在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找擬南芥、水稻、葡萄、山核桃、芒果等5個物種的LFY同源基因的啟動子序列，應(yīng)用在線FootPrinter3.0軟件對這幾個物種以及LLFY的啟動子序列進行比擬。2結(jié)果與分析2.1LLFY

7、啟動子的克隆采用染色體步移方法進行兩輪PCR的擴增后，獲得了一條約700bp特異性片段圖1，測序結(jié)果說明該PCR產(chǎn)物大小為683bp，圖2中下劃線局部為啟動子序列。將克隆到的序列與先前獲得的LLFY局部5端非編碼區(qū)序列進行拼接，得到LLFY起始密碼子ATG上游的啟動子序列共809bp，結(jié)果見圖2。圖1龍眼LLFY基因啟動子第二輪PCR擴增產(chǎn)物M.DL2000marker;1.PCR擴增產(chǎn)物Fig.1SecondroundPCRproductofLLFYpromoterinlonganM.DL2000marker,1.PCRproduct2.2LLFY啟動子序列的分析首先用PlantCARE軟件

8、在線分析LLFY啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點TFB及其功能，結(jié)果見表1。從表1可以看出，809bp的LLFY啟動子片段中在-125等4個位置含有典型的TATA-box序列，在-98等6個位置含有CAAT-box序列，TATA-box和CAAT-box是啟動子區(qū)域的根本順式作用元件；在此序列中還發(fā)現(xiàn)在-595處有一個與生理周期調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，說明LLFY的表達(dá)與植株的生理周期有關(guān)；-182位置是厭氧誘導(dǎo)的順式元件，序列中還有4個干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、1個光誘導(dǎo)MYB位點和ABA響應(yīng)元件(ABRE)，這些調(diào)控序列的存在說明LLFY的表達(dá)可能受干旱、光照、氧氣等環(huán)境因素以及激素ABA的調(diào)

9、控。此外，該序列中還發(fā)現(xiàn)一些光響應(yīng)元件如GA-box、GAG-motif、I-box等。應(yīng)用FootPrinter3.0軟件對龍眼、擬南芥(NC_003076.8)、水稻AF397034.1、葡萄EF222286、芒果GU338039.1、山核桃DQ9892266個物種LFY同源基因啟動子序列進行比擬，找出保守區(qū)域，繪出系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示6個物種LFY啟動子區(qū)域共有的保守基序有4個圖3，保守區(qū)域數(shù)目不多，說明LFY同源基因間啟動子序列差異較大。表1應(yīng)用PlantCARE預(yù)測LLFY啟動子順式作用元件Table1Cis-actingregulatoryelementsanalysisofLLF

10、YpromotersequencebyPlantCARE 位點名稱 Site Name 位置 Position 信號序列 Signal sequence 位點功能 Function of site CAAT-box -802、-527、-447、-98 CCAAT 啟動子區(qū)域順式作用元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions -391、-190 gGCAAT TATA-box -689、-514、-211、-125 TATA 轉(zhuǎn)錄起始-30核心啟動子元件 core promoter element around -

11、30 of transcription start circadian -595 CAANNNNATC 參與生理周期調(diào)控的順式作用元件 cis-acting regulatory element involved in circadian control ARE -182 AAACCA 厭氧誘導(dǎo)必要的順式作用元件 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction MBS -579、-346 CAACTG 干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點MYB binding site involved in drought-indu

12、cibility -169 CAGTTA -238 CAACTG MRE -246 TTAGGTT 光響應(yīng)MYB結(jié)合位點 MYB binding site involved in light responsiveness ABRE -476 GCCACGCACT 脫落酸響應(yīng)順式作用元件cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness GATA-motif -442 CCCTATC 局部光響應(yīng)元件 part of a light responsive element I -box -775 AAGATAAGGCT 局部

13、光響應(yīng)元件 part of a light responsive element Sp1 -378 GGGAG 光響應(yīng)元件 light responsive element MNF1 -376 AGGGCAC light responsive element 光響應(yīng)元件 GAG-motif -112 CATCTCT 局部光響應(yīng)元件 part of a light responsive element GA-motif -13 AAGGAAGA 局部光響應(yīng)元件 part of a light responsive element Skn-1_motif -722 ATG AC 胚乳表達(dá)需要的順式

14、作用元件 cis-acting regulatory element required for endosperm expression O2-site -776 GATGATATGG 玉米醇蛋白代謝途徑順式作用元件 cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation -809 CATCATGCCAATGTAAATTAGCACTTGCAGATAGATGATAAGGCTAAAGCTGTAAACTTA CAAT-box I -box -749 TGTGTAAAGCGATTTCCATTTTTAGGAATGACTTG

15、GCACTTGCAGACAGCCATAATTTTT Skn-1_motif -689 TATAAAACCTTGATATCAAAAATAAAAGGAAAAGTTTCATCCTTAGGGACAGAGGATGCA TATA-box -629 TTTAGCAAAGAAACTGCCCTAATAGCATCCACTTCAACGAAATCCACCTTCAACTGTAAG circadian MBS -569 GAATAGGCAAGCAACAAACCTTCTCTTAGAGCGACCGATTCACCAATTTTTGGGCTATAG CAAT-box TATA-box -509 TTACCTTTCCAAGGATTC

16、GTTGTAGCAACTATGGCCACGCACTGATGATTATGGAAGCAA ABRE -449 CACCAATCCCTATCATGAGAGAGCTAGAGCAAATGGCTACATCTGAGTTTGAGTTTTAGG CAAT-box GATA-motif -389 CAATCATAAAGGGGAGGGCACCAACTAGGAACAGACGAAGCAGCAACTGATTTAGGCAAA CAAT-box Sp1 MNF1 MBS -329 ATAAACATGGCTACTTTAGCGTTTTGGAATTCTCGTTAGGAGAATGTAAGGTAAGTCACC -269 AAGGCGA

17、GACTCAGTTTGAGTGGTTAGGTTCCAACTGTCAAGTTCCAAACTAACAGAATA MRE MBS -209 TATGAACCACATTTTCCTTGGCAATAAAAACCATAAAAATCAGTTATTTGAGGGCAGTAT TATA-box CAAT-box ARE MBS -149 CGTGAACACAGAAACAGCAGCCTTTATAGCAAACCTACATCTCTCTGCTGCCCAATTCCA TATA-box GAG-motif CAAT-box -89 GAACATAAAAGATATTCACTGCTCACGAGTGCTAAGAGGGCAAAAACA

18、AAACAAAAAATA -29 AAAAATAAAGACGAAAAAGGAAGACAGACATG GA-motif 圖2龍眼LLFY基因啟動子局部序列啟動子根本元件用方框表示；其它調(diào)控元件用陰影表示；起始密碼子用粗體表示；引物用下劃線表示Fig.2PartialsequencesofLLFYpromoter3討論啟動子序列分析說明LLFY啟動子區(qū)域含有豐富的可能是順式作用元件的序列，LLFY表達(dá)調(diào)控受內(nèi)在因素和多種外界條件的影響。如LLFY表達(dá)受生理周期的影響，可能是導(dǎo)致花芽分化具有周期性原因；啟動子序列中含有多個光響應(yīng)作用元件，說明LLFY的表達(dá)受光調(diào)控；生產(chǎn)中KCIO能夠誘導(dǎo)龍眼成花，可

19、能與LLFY啟動子含有干旱誘導(dǎo)順式作用元件有關(guān)，是由于施用KCIO產(chǎn)生了干旱脅迫。LLFY表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性也說明了LLFY可能具有多種功能。如LLFY啟動子中還發(fā)現(xiàn)有厭氧誘導(dǎo)等順式作用元、胚乳表達(dá)需要的順式作用元件以及玉米醇蛋白代謝途徑順式作用元件等，這些元件是否與LLFY的其它功能有關(guān)有待進一步研究。龍眼LLFY啟動子序列的克隆也為進一步采用酵母單雜交等方法獲得與LLFY互作的調(diào)控蛋白創(chuàng)造條件。對一些物種的研究說明在進化過程中，LFY同源基因的功能出現(xiàn)分化，不僅控制著花的發(fā)育，在被子植物的發(fā)育過程中還起著其它的調(diào)控功能。例如，單子葉植物水稻中LFY的同源基因RFL表達(dá)明顯區(qū)別于雙子葉植物，R

20、FL基因在幼穗中表達(dá),而在成熟的小花和葉子中沒有表達(dá)。葡萄VFL在即將發(fā)育成花序的分生組織中、花序芽中都有表達(dá)，在花芽中的表達(dá)到達(dá)最高，在葉芽、葉片和卷須原基中也有微量表達(dá)，作者認(rèn)為VFL除了在開花過程的重要功能外，還參與未分化的分生組織的維持。而龍眼LLFY參與花序的分化和維持，在沖梢;過程LLFY表達(dá)量下降。葡萄等LFY同源基因啟動子序列中都有MYB、ABRE和光響應(yīng)等元件，龍眼中也發(fā)現(xiàn)了這些元件，但LLFY啟動子中沒有發(fā)現(xiàn)擬南芥中的CArG盒和GA的順式作用元件，也沒有找到葡萄中的茉莉酮酸酯誘導(dǎo)順式作用元件、細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因ARR1結(jié)合位點等序列。將水稻、擬南芥與包括龍眼在內(nèi)的4種果樹

21、LFY同源基因啟動子進行保守序列分析，結(jié)果說明它們共同的保守序列只有4個，這為解釋不同物種LFY同源基因存在表達(dá)和功能差異提供了證據(jù)。如果僅將4種果樹的LFY同源基因啟動子序列進行比擬，保守序列到達(dá)24個數(shù)據(jù)未列出，說明木本植物L(fēng)FY同源基因啟動子序列相似性更高。以上試驗的分析結(jié)果也說明了龍眼LLFY基因作為花分生組織特性基因的保守性，但功能及表達(dá)調(diào)控上與其它物種存在差異。 葡萄 芒果 山核桃 擬南芥 龍眼 水稻 圖3FootPrinter軟件對6個LFY同源基因啟動子的分析結(jié)果Fig.3AnalysisofsixLFYhomologgenespromotersbyFootPrinter設(shè)定元

22、件長度為8，最多兩個突變位點，子區(qū)域設(shè)定為100bp，不同顏色顯示不同的轉(zhuǎn)錄元件。參考文獻1 WEIGEL D, ALVAREZ J, SMITH D R, YANOFSKY M F, MEYEROWITZ E M. LEAFY controls Floral meristem identity in Arabidopsis.Cell,1992,69:843-859.2 BLZQUEZ M A, WEIGEL D.Integration of floral inductive signals in Arabidopsis.Nature,2000,404:889-892.3 SABLOWSKI

23、R.Flowering and determinacy in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany Advance,2007,10:1-9.4 YAMAGUCHI A,WU M F,YANG L,WU G,PORTHIG R S,WAGNER D. The microRNA regulated SBP-box transcription factor SPL3 is a direct upstream activator of LEAFY, FRUITFULL, and APETALA1. Dev Cell. 2021 ,17(2): 2682

24、78.5 MAIZEL A, BUSCH M A, TANAHASHI T, PERKOVIC J, KATO M, HASEBE M, WEIGEL D. The floral regulator LEAFY evolves by substitutions in the DNA binding domain.Science,2005,308:260-263.6 LEE J, OH M, PARK H, LEE I. SOC1 translocated to the nucleus by interaction with AGL24 directly regulates LEAFY.The

25、Plant Journal,2021,55:832843.7 LEE J, LEE I. Regulation and function of SOC1, a flowering pathway integrator. J Exp Bot,2021,61(9):2247-54.8 BLZQUEZ M A, GREEN R, NILSSON O,SUSSMAN M R, WEIGEL D. Gibberellins p romote flowering of arabidopsis by activating the LEAFY promoter.Plant Cell,1998,10(5):791-800.9 ZONG Cheng-wen, ZHANG Zhen, FANG Jing-gui,TAO Jian-min, ZHAO Mi-zhen. Cloning and sequence analysis of LEAFY gene pr omoter f