超氧化物歧化酶SOD的分離純化技術(shù)

1、實(shí)訓(xùn)三超氧化物歧化酶SOD的分離純化技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)原理：通過(guò)對(duì)綠豆種子的研磨破碎獲得SOD粗酶，經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)分離、透析除 鹽和濃縮等過(guò)程，除去粗酶液中的雜質(zhì)及干擾蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝膠層析得到純化的SOD酶。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法：一材料:綠豆種子，市售新鮮綠豆種子浸泡蒸餾水24小時(shí)備用.二試劑:葡聚糖（sephadexG-100 或 G150）, NaCl（AP）,磷酸氫二鈉（AP）, 磷酸二氫鈉（AP）,三羥甲基氨基甲烷（Tris）,鹽酸（濃鹽酸），硫酸銨（AP）, PEG6000,考馬斯藍(lán)G250 ,磷酸，乙醇（AP），牛血清蛋白BSA ,連苯三酚 （焦性沒(méi)食子

2、酸）,甲硫氨酸（methionine） , NBT （氮蘭四唑Nitroblue Tetrazdinna）,核黃素，EDTA（鈉鹽），超氧化物歧化酶（sigma公司），三 儀器：離心機(jī)WFZ-UV2000型紫外分光光度計(jì)201X7 （717）強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂勻漿機(jī)、各型號(hào)燒杯、試管、量筒、帶毛塞試管、漏斗、移液槍、移液管、 玻璃棒、四實(shí)驗(yàn)方法和步驟：稱量25g綠豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，勻漿，兩層紗布過(guò)濾，離心（3000rpm） 15Min取清液，取少量樣為樣，測(cè)量SOD活性、蛋白質(zhì)含量 測(cè)量，計(jì)算SOD總活性單位及活性單位。所得清液測(cè)量總體積，緩慢40

3、%飽和（NH4）2SO4至濃度為19.4g/100ml，4C 冰箱靜置分層。離心（3000rpm）取清液，取少量為樣，測(cè)量SOD活性、蛋白質(zhì)含量測(cè) 量，計(jì)算SOD總活性單位及活性單位。步驟3中的清液緩慢加入硫酸銨至75%飽和度（8.7g/100ml）（過(guò)程充分?jǐn)嚢瑁?5C至分層，離心（3000rpm）取沉淀，取樣，計(jì)算SOD總活性單位及活 性單位。裝入透析袋中，于蒸餾水中5C透析過(guò)夜。透析后溶液用濾紙過(guò)濾得清液，重新裝入透析袋中用PEG濃縮。裝柱：1）排氣加蒸餾水一留15%體積水2） 100mL G100 一次裝完3）靜置10min 打開(kāi)出液口 一 排過(guò)量洗脫劑4）保留離膠面2-3cm接洗脫

4、瓶 一平衡30min 理想流速注意膠面始終保持水層洗脫瓶：pH7, 0.02MPb層析過(guò)程樣品：濃縮y 一離心一 過(guò)濾一 J體積31mLI取樣上樣：5 %上樣量2 3mol洗脫:1mL/min,3mL/ 支，共收 100120mL*測(cè)（1） a280值（2）SOD活性（粗略）20支管 每支3mL（3）搜集活性峰并測(cè)酶活性9.比活力、得率及純化倍數(shù)計(jì)算：SOD的比活力按下面公式計(jì)算:%。的比活力=酶液活力WL）酶液蛋白含量3幻,部）三、結(jié)果與討論一 SOD活性及蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果：蛋白質(zhì)含量測(cè)定：表1.牛血清制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（牛血清單位為 0.1mg/ml）蛋白質(zhì)（mg） 0001 0020030

5、040.050圖1.牛血清制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（牛血清單位為0.1mg/ml）二 硫酸銨分級(jí)分離、透析除鹽和濃縮過(guò)程表2.連苯三酚測(cè)樣品SOD活性（A325）連苯三 酚/ul酶/ulA樣50500.021樣55200.025樣57480.033表3.考馬斯藍(lán)G-250測(cè)樣品蛋白含量（A595）:樣品體積/ul第一次測(cè)量第二次測(cè)量OD平均值（nm）樣100.5660.5580.562樣100.2910.2930.292樣1200.1150.1200.118根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量：樣 0.067mg樣 0.035mg樣 0.016mg（三）葡聚糖凝膠層析分離純化SOD實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4.葡聚糖G

6、100凝膠層析洗脫曲線（以A280吸收作為蛋白質(zhì)含量的相對(duì)值）試管號(hào)吸光值（nm）(1 0.059(20.079(30.019(4 0.083(5 0.048(6) 0.044(7) 0.04試管號(hào)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)吸光值（nm）0.0240.0210.030.0170.0310.0230.018試管號(hào)（15）（16）（17）(18)(19)(20)吸光值（nm）0.0190.0110.0130.0180.0200.023圖2.葡聚糖Sephadex G100凝膠層析分蛋白質(zhì)洗脫曲線經(jīng)連苯三酚粗測(cè)，（3）號(hào)管顏色最淺，而根據(jù)蛋白質(zhì)洗脫曲線看出（3）號(hào)管 位于蛋

7、白質(zhì)含量峰上，所以選?。?）號(hào)管作為目的試管收集SOD，測(cè)量其準(zhǔn)確 SOD活力和蛋白含量，計(jì)算SOD比活力。表6.考馬斯藍(lán)G-250測(cè)收集試樣的蛋白含量（A595）：豆液稀釋倍數(shù)第一次測(cè)量第二次測(cè)量平均值（nm）-試管 30.1210. 1150.118計(jì)算得：加入酶量相當(dāng)?shù)拿富盍挝?unit)= (AA-AA) /AA*2樣 (0.078-0.021)/0.076*2=1.51樣 (0.063-0.025)/0.063*2=1.21樣 (0.074-0.041)/0.074*2=0.89試管 3 (0.074-0.054)/0.074*2=0.54提取液的總活力(unit)=加入酶量相當(dāng)?shù)?/p>

8、酶活力單位* (反應(yīng)液總體積/取樣液體 積)*稀釋倍數(shù)樣 1.51* (219/0.050) =6613.8樣 1.21* (221/0.055) =4862樣 0.89* (50/0.048) =929.05試管 3 0.54* (3/0.065) =24.92SOD總得率為：總得率=最后樣品活率/樣1活率*100%=24.92/6613.8*100%=0.3768%SOD的比活力為=總活力(units) /總蛋白量(mg)樣 6613.8/1467.3=4.51樣 4862/773.5=6.29樣 929.05/80 =11.61試管 3 24.92/2.95=8.45純化倍數(shù)=比活2/比

9、活16.29/4.51=1.4014.45/4.51=3.208.45/4.51 =1.87（四）實(shí)驗(yàn)總結(jié)及討論:根據(jù)以上數(shù)據(jù)，計(jì)算各步提純中酶的總活力:A325加樣體積（ml總體積（ml）總活力（U）樣0.0310.052216613.8樣0.0250.0552194862樣0.0410.05750929.05試管（3）0.1430.30324.92總蛋白含量計(jì)算:取樣蛋白質(zhì)含量稀釋倍數(shù)加樣體積（ml）總體積（ml）總蛋白含量（mg）(mg)樣0.0670.012191467.3樣0.0350.01221773.5樣0.0160.015080試管（3）0.1180.1232.95純化步驟總活

10、力（U）總蛋白（mg）比活(U/ mg pro.)純化倍數(shù)粗酶液（樣）6613.81467.34.5140%硫酸銨鹽析（樣）4862773.56.291.40透析后（樣）1156.258014.453.20葡聚糖凝膠層析（試管3）76.2092.958.451.87試管號(hào)化步驟活變化o o O o o O 0 8 6 化步驟活變化o o O o o O 0 8 6 TX00400o21600圖3.各純中SOD總酶1400趨勢(shì)1200圖4.各純化步驟中SOD總蛋白含量變化趨勢(shì)圖5.各純化步驟中SOD比活變化趨勢(shì)1.可以看出，在25g綠豆中隨著不斷的分離提純，總活力不斷減小，比活力不斷 上升，最后

11、總純化倍數(shù)為1.87，活性得率為0.3768%，沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果。為什么要從植物中提取SOD？初步驗(yàn)證階段。國(guó)外SOD主要應(yīng)用于醫(yī)療、保健方面，有以動(dòng)物血液及內(nèi) 臟為原料制取SOD的報(bào)導(dǎo)，但存在著成本高、含有致熱因子等缺陷，因此，適 用范圍極為有限。尤其是近年來(lái)受“瘋牛病”的影響，許多國(guó)家和地區(qū)抵制以動(dòng) 物血液及內(nèi)臟為原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在國(guó)際市場(chǎng)上 極為緊缺。從植物，特別是人們?nèi)粘＝?jīng)常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取SOD， 使用安全性非常高，避免了可能發(fā)生的交叉感染。利用全新的生物技術(shù)從植物中 提取SOD，具有明顯的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，市場(chǎng)前景廣闊。從植物中提取SOD的 主要工藝流程為:植物一打漿一超濾分離一有機(jī)溶劑去雜一柱層析精制一超濾濃 縮一冷凍干燥一產(chǎn)品用Tric-HCl而不用磷酸緩沖液的原因因?yàn)榉磻?yīng)物連苯三酚在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下能自氧化。而SOD 活力的測(cè)定是依