熒光顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用

1、熒光顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用摘要：熒光顯微鏡是在光鏡水平上，對(duì)細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、 糖類、脂質(zhì)以及某些離子等組分進(jìn)行定性研究的有力工具。本文綜述 了結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡、隱失波熒光顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用。 關(guān)鍵詞：熒光顯微鏡;應(yīng)用熒光顯微鏡具有可特異性標(biāo)記、可對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像 的優(yōu)勢(shì)，在生命科學(xué)研究中獲得了廣泛的應(yīng)用E，利用熒光顯微鏡觀 測(cè)生物活體和固定的細(xì)胞是研究目標(biāo)蛋白定位和動(dòng)態(tài)的一種重要手 段。隨著熒光標(biāo)記和新的顯微成像技術(shù)，如激光共聚焦顯微鏡和轉(zhuǎn)盤 式共聚焦顯微鏡的廣泛應(yīng)用，使人們對(duì)于細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過程有了更深 入的了解。1.結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡突破衍射極限的原理和在生

2、命科學(xué)中 的應(yīng)用結(jié)構(gòu)光照明是一種通過改變照明光空間結(jié)構(gòu)的照明方式，通常照 明的結(jié)構(gòu)光是一個(gè)載頻條紋，這種照明方式可應(yīng)用于角度、長(zhǎng)度、振 動(dòng)等的測(cè)量，并廣泛應(yīng)用于三維成像。4。結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡， 是在寬場(chǎng)熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，利用特殊調(diào)制的結(jié)構(gòu)光照明樣品，運(yùn) 用特定算法從調(diào)制圖像數(shù)據(jù)中提取焦平面的信息，突破衍射極限的限 制，重建出超分辨切層的三維圖像。將結(jié)構(gòu)光照明應(yīng)用于熒光顯微鏡， 具有成像速度快、光路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、對(duì)熒光分子無特殊要求、能夠應(yīng)用 于活體細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)三維成像的優(yōu)勢(shì)，因而在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域引起 了廣泛關(guān)注，是應(yīng)用前景廣泛的超分辨熒光顯微技術(shù)。熒光顯微鏡由于其無損、非入侵的觀察方式和特

3、異性標(biāo)記識(shí)別的 特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。但是由于其分辨率受到衍射極限 的限制，細(xì)胞內(nèi)許多復(fù)雜的精細(xì)結(jié)構(gòu)無法觀察到。結(jié)構(gòu)光照明熒光顯 微鏡作為一種能夠突破衍射極限的熒光顯微鏡，大大提高了細(xì)胞結(jié)構(gòu) 成像的分辨率和圖像清晰度，有力地促進(jìn)生命科學(xué)研究的發(fā)展。2.隱失波熒光顯微鏡及其在植物細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用應(yīng)用隱失波熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞膜附近生物學(xué)過程的優(yōu)點(diǎn)是，它 只激發(fā)生物樣品靠近蓋玻片附近一薄層區(qū)域內(nèi)的熒光基團(tuán)。所謂生物 學(xué)過程包括：追蹤單個(gè)分子與膜結(jié)合以及與膜分離的過程，配體與細(xì) 胞膜表面受體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，胞吞胞吐過程以及其它定位于細(xì)胞膜的 分子的動(dòng)態(tài)等。2. 1細(xì)胞膜表面的受體隱失波熒光顯

4、微鏡可以用于研究細(xì)胞膜表面受體與配體結(jié)合的 動(dòng)力學(xué)，受體的聚集以及它們的橫向運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞膜表面的受體可通 過熒光基團(tuán)標(biāo)記的配體、抗體或其它小分子進(jìn)行標(biāo)記，甚至還可用熒 光蛋白（如GFP、m Cherry等）對(duì)感興趣的受體進(jìn)行標(biāo)記。2.2胞吞與胞吐迄今為止，已有許多研究利用隱失波熒光顯微鏡對(duì)胞吐過程進(jìn)行 觀測(cè)，其中包括應(yīng)用styryl染料（如FM4-64和FM1-43）或帶有熒 光基團(tuán)的貨物標(biāo)記正在胞吐的囊泡，以觀測(cè)單個(gè)胞吐的過程。通常在 觀測(cè)過程中，只有當(dāng)胞吐的囊泡進(jìn)入到隱失波范圍內(nèi)，其熒光基團(tuán)才 可被激發(fā)而發(fā)出熒光；而當(dāng)囊泡與細(xì)胞膜融合時(shí)，由于囊泡內(nèi)容物釋 放到細(xì)胞外或擴(kuò)散到細(xì)胞膜上，熒光信號(hào)

5、就會(huì)迅速消失2.3植物細(xì)胞中的應(yīng)用由于植物細(xì)胞有細(xì)胞壁，且隨著植物的種類、細(xì)胞的類型、植物 的生長(zhǎng)時(shí)間、生長(zhǎng)狀況及水分含量的不同，細(xì)胞壁的厚度也會(huì)有很大 的變化。另外，植物細(xì)胞并不像培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有較好的貼壁性，如 果直接利用隱失波熒光顯微鏡觀測(cè)植物細(xì)胞仍存在一定的局限性，然 而，近年來隨著觀測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，隱失波熒光顯微鏡在植物細(xì) 胞的研究中一定會(huì)得到越來越廣泛的應(yīng)用6。本課題組已搭建了隱 失波熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，并利用其對(duì)轉(zhuǎn)氨蛋白ATM、水通道蛋白 PIP2、藍(lán)光受體Photol以及網(wǎng)格蛋白CLC在細(xì)胞膜上動(dòng)態(tài)時(shí)行了 觀測(cè)分析。2. 4植物細(xì)胞內(nèi)吞的研究當(dāng)應(yīng)用隱失波熒光顯微鏡對(duì)整株擬南芥

6、幼苗中定位于細(xì)胞膜的蛋 白和靠近細(xì)胞膜的細(xì)胞器及細(xì)胞骨架進(jìn)行觀測(cè)，所得結(jié)果與熒光顯微 鏡或激光共聚焦顯微鏡相比，顯然隱失波熒光顯微鏡能得到信噪較高 的圖像。目前，結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的使用主要集中在生命科學(xué)研究領(lǐng)域， 擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域也將是未來研究的方向。通過改進(jìn)技術(shù)以及擴(kuò)展應(yīng)用 范圍，結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡將促進(jìn)科學(xué)研究的發(fā)展。近年來隱失波熒光 顯微鏡在國(guó)際上已逐漸商業(yè)化，并成為實(shí)驗(yàn)室中一種不可缺少的常規(guī) 實(shí)驗(yàn)儀器，它在生命科學(xué)的研究中作為觀測(cè)植物樣品表面的一種新技 術(shù)將有著十分廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)：吳美瑞，楊西斌，等.結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡突破衍射極限的原理和在生命科學(xué)中的應(yīng)用J.激光與電子學(xué)進(jìn)展,2015,52:010003蘇顯渝，張啟燦，陳文靜.結(jié)構(gòu)光三維成像技術(shù)J.中國(guó)激光，2014, 41(2)： 0209001.柳迪，姚振寧，李海峰，等.基于波長(zhǎng)分離的結(jié)構(gòu)光采集系統(tǒng)N.光學(xué)學(xué)報(bào)，2012, 32(6)： 0612003.彭祎帆，陶毅陽，于超，等.基于紅外結(jié)構(gòu)光的三維顯示用交互裝置J.光學(xué)學(xué)報(bào)，2013, 33(4)： 0412005.何化，任吉存.全內(nèi)反射熒光成像技術(shù)及其在