免疫組化的原理與操作

1、Immunohistochemistry免疫組化概述概念:免疫組織化學(ImmunohistochemistryJHC)是利用抗原抗體反應和組織化學呈色反應來檢測組織和細胞中某種化學成分的一門技術，是傳統(tǒng)的免疫學和組織化學相結合而發(fā)展起來的一門新興學科，也叫原位免疫學(Insituimmunology)。特點或優(yōu)點:(1)特異性強、靈敏度高;(2)可定性、定位、定量觀察;(3)將形態(tài)學改變與功能和代謝變化結合起來;IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學（包括LM和EM水平）能對組織和細胞進行仔細、客觀觀察的優(yōu)點（特別是經(jīng)蘇木精或伊紅復染后），而且還克服了傳統(tǒng)免疫學反應只能定性和定量（離體、液相），而不能定位

2、的缺點。IHC則可在原位和固相對染色結果進行觀察。目前IHC的定位可精確到亞微結構水平。Ill隨著IHC技術的發(fā)展和圖象分析技術的發(fā)展,IHC已進入多標記（雙標記）和定量研究的階段，使IHC在生物學和醫(yī)學各領域的應用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。IHC與核酸分子雜交相結合形成的原位雜交技術（insituhybridization,ISH）既特異性強、靈敏，又具定位、可視的特點。一、IHC的發(fā)展簡史IHC技術源于免疫熒光術(immimofhiorescence,IF),從1941年1950年Coons等用了10年首創(chuàng)了熒光素標記抗體技術一一檢測肺組織內的肺炎雙球菌，六、七十年代IF在科研中

3、占據(jù)著主導地位1968年中根一穗(Nakane)等創(chuàng)建了酶標抗體技術(immunoperoxidase,IPO)鐵蛋白標記Ab技術；1974年Stemberger改良上述技術，建立辣根過氧化物酶一抗體過氧化物酶(PAP)技術，使免疫細胞化學得到廣泛應用；80年代Hsu等建立了ABC法之后,免疫金一銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡技術相繼問世。90年代分子雜交技術、原位雜交技術、免疫細胞化學分類方法迅速發(fā)展；1=2000年各種免疫組化技術更加成熟，使免疫組化技術成為當今生物醫(yī)學中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應用范圍深達醫(yī)學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一；國內起步

4、晚，從70s開始。二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景（一）方法學1從傳統(tǒng)的抗原、抗體反應（免疫反應）T親和反應。新的親和物質對有：生物素與卵白素（biotin&avidin）,葡萄球菌A蛋白（SPA）與IgG,凝集素與受體，激素與受體。這些親和對親和力強，且可與多種標記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結合，由此產生了親和組織化學（affinityhistochemistry）,這些方法特異性、敏感性、穩(wěn)定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如EM）。2從單一顯示某種物質（單標記）T顯示多種物質（雙標記）。3從LM-EM（超微結構）:免疫電鏡、膠體金法、金銀法。4從定性定量，圖象分析（IA）、流式

5、細胞術（FCM）o5.IHC與ISH相結合，可在不同水平檢測DNA.mRNA、proteino6原位PCR+IHC可在組織原位通過擴增檢測微量目的DNA。7趨于標準化、自動化。（二）技術分類根據(jù)染色方式分成：貼片染色漂浮染色根據(jù)AgAb結合方式分成：直接法間接法多層法按標記物的性質分成：免疫熒光技術（免疫熒光法）免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD法、ABC法）免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）(三)標記物1必要性：組織細胞內Ab結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。常用標記物熒光素:最常用的是異硫一氤酸熒光素(Fluoresceinisothioc

6、yanate,FITC)熒光顯微鏡下呈綠色熒光；四乙基羅達明(rhdamineRB200)熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。生物素:(Biotin)鐵蛋白金等:主要應用于免疫電鏡。其他：如同位素(因涉及污染和防護難一般不用)（四）IHC的應用1只要是形態(tài)科學均可釆用:包括病理學、神經(jīng)科學、生物學、病原微生物的檢測（病毒、細菌、寄生蟲等）、皮膚病學、器官移植等。2.可用于多種材料：A.各種組織（冰凍組織、formalin固定組織、石蠟包埋組織兼可）；B.各種細胞（穿刺、體液、涂片、血細胞、培養(yǎng)細胞等）。3用于診斷：腫瘤病理學等（大中醫(yī)院）。FA4用于科研：臨床和基礎醫(yī)學，尤

7、其是形態(tài)學專業(yè)研究生常用IHC,或IHC+分生技術；最近幾年，分子生物學研究異常活躍，但最終還要歸到形態(tài)上來，用免疫組織化學方法對所研究的大分子進行定位，進而深入研究其功能。三、樣品的準備、處理(一)標本的收集與處理IHC染色成功與否及其質量如何，除染色方法本身外，對材料的處理也至關重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的數(shù)量及活性、保持組織細胞的良好形態(tài)結構。材料的來源：人體及實驗動物；細胞和組織；新鮮的及固定的。1、組織標本的取材與儲存來源：活檢取材、手術切除、實驗動物組織等。要求：要快、要小(1X1X0.4cm),避免擠壓。處理：冰凍-即用或保存；固定-即用或保存

8、。2、細胞標本的取材與儲存來源：血細胞、穿刺細胞、體液細胞等。處理：細胞多時直接涂片、干燥、固定、染色；細胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色;對于體外培養(yǎng)細胞：貼壁生長細胞（內皮C、纖維C、神經(jīng)C等）在培養(yǎng)皿底置載玻片；懸浮臺長細胞需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。（二）固定（fixation）1、固定的含義固定是指以某種化學物質使蛋白質、酶類（變性）、脂質、糖類等物質保持在組織細胞原位，避免Ag溶解、擴散、丟失；保持組織細胞的正常形態(tài)結構。根據(jù)Ag對固定劑的耐受性，可將其分為：不穩(wěn)定Ag（如細胞表面Ag,不耐甲醛，宜用丙酮）、半穩(wěn)定Ag及穩(wěn)定Ag,后二者多為蛋白、肽類、酶類物質。

9、固定有時間性，太短達不到固定目的，太長交聯(lián)過度，封閉Ag。2、常用固定劑及其用途1.10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）:以pH7.4的PBS配制，優(yōu)點：穿透力強、固定快、組織收縮??；適于固定蛋白、肽類、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，時間46h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛與2%多聚甲醛混合液固定，尤對超微結構保存好。醛類固定劑的缺點是易封閉抗原，必要時需抗原修復。3.70%的酒精（乙醇），優(yōu)點：固定蛋白好，缺點：組織收縮嚴重；時間：2ho70%丙酮，優(yōu)點：滲透快；缺點：對形態(tài)保存不好；用于對冰凍切片和

10、細胞涂片的固定；時間：lOmin?；旌瞎潭ㄒ海築onin液：40%PF250mk冰醋酸50ml、飽和苦味酸250ml；還有PLP固定液，較適合免疫組化。四氧化娥（OsO4酸）：常用PBS配制1%娥酸溶液后固定lh,用于免疫組化及電鏡觀察。有強烈刺激，需在通風櫥內操作。（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動切片不需此步驟。切片可分為：石蠟切片：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片57呻；冰凍切片：浸糖，20%30%蔗糖4吃過夜，減少冰晶；OCT包埋；液氮速凍，減輕組織破壞。病理切片要薄，57“m；腦片通常3050ym厚。振動切片：不需做任何包埋，固定后的組織可直接用振動切

11、片機做各種厚度的切片，并在染色后可進一步制作電鏡標本觀察O防脫片劑蛋白甘油，蛋清與甘油1:1攪拌、過濾、防腐；1%的洛磯明膠涂片；0.1%的多聚賴氨酸涂片，晾干備用。配制時用塑料瓶而不能用玻璃瓶；購買商品化的進口硅化玻片；APES(氨丙基三乙氧基硅烷),1：50丙酮稀釋，浸片2030秒，晾干備用；貼片時要一步到位。（五）抗原修復近年興起的新技術。目的：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。主要適用于經(jīng)長期formalin固定商標本、石蠟包埋標本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：（1）微波加熱切片煮沸10-20min,室溫自然冷卻，所用溶液有：飽和NaCL溶液；10mMpH60的枸椽酸鈉緩沖液；4M的尿素等；p

12、H80TBS;（2）高壓鍋處理將切片放入10mMpH6.0的枸椽酸鈉緩沖液容器中，置鍋內加蓋噴氣3-10min,自然冷卻。（3）酶消化處理：常用01%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2,pH7.8)37。ClOmin?；?.4%胃蛋白酶37。C30min;（）基本染色方法熒光素標記抗體：FITC、直接法TRITC等標記抗體法酶標記抗體：HRP、AP等”熒光素標記抗體間接法酶標記抗體（三步法）非標記抗體法：酶橋法、PAP法、APAAP法；親和組化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法；雙重標記：阻斷法（酸洗I抗）、非阻斷法（連續(xù)染）1.直接法熒光素直接標記特異性抗體（一抗）上，標記抗體與抗

13、原結合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察-檢測抗原。優(yōu)點：簡單，時間短,特異性強。缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟）。應用：基本不用了！2.間接法熒光素標記在二抗上（二抗：抗產生一抗動物的igG抗體）。顯色后鏡檢Ab*I+AgAgAbI+Ab-II-熒光素ArAbl-AbI卜熒光素（熒光顯微兢檢測）I三1-1特點：1、敏感性較直接法高3-4倍，但特異性較低;2、不必標記每種一抗，只需標記某一種動物的二抗；3、一抗可高度稀釋，節(jié)省一抗，且可用PBS代替一抗做空白對照。3.非標記Ab橋法:“橋法”是酶標記抗體的改進，經(jīng)過三次抗體,其二抗為未標記橋抗體。(1)單橋法+Ab-III11兔源抗體I-*Ab

14、-II+底物(2)雙橋法在三抗之后，將二抗和三抗再重復一次,可增大染色強度。特別提示：注意動物種屬關系特點：敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結合的酶不易洗去，背景染色重。4.過氧化物酶一抗過氧化物酶法(Peroxidaseantiperoxidasemethod,簡稱PAP法)是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”,先與第一抗體結合，再與PAP復合物聯(lián)結，形成抗原一抗體一抗IgG抗體一PAP復合物,最后用底物顯色劑顯色。特點：靈敏度高，比間接熒光法敏感20倍，比間接酶標記抗體法敏感100倍5.親和素生物素過氧化物酶復合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplext

15、echnique,簡稱ABC法)o關鍵的程序步驟為3步:Ag+Abl+(Ab2-B)+ABC復合物(Ab2-B為生物素標記的第二抗體)(B為生物素標記的過氧化物酶)ABiIrC復合物是avidin與酶聯(lián)biotin在使用前30min配置，混勻。1個avidin分子結合了3個biotin分子，剩下1個結合點與2抗的生物素結合，avidin起橋聯(lián)作用。(1)ABC復合物的制備:親合素一生掬素一P0生物素十過氧化物酶CPO)生物素一F0囂(2)ABC法反應原理:ODABHzOz特點：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感2040倍，背景也更清晰。Ajidriinny/-nlJt-cvABC法示意圖染色結

16、果觀察(BrdU)6、酶標親和素生物素技術（labelledavidin-biotintechnique,簡稱LAB法)o即用辣根過氧化物酶直接標記avidin,用biotin標記2抗。關鍵步驟為3步:Ag+Abl+（Ab2-B）+A（A為HRP標記的卵白素）A與2抗的生物素結合，avidin起橋聯(lián)作用。如將該法中的卵白素(avidin)變換成鏈霉卵白素(streptavidin),LAB法即成LsAB法，或稱SP法。據(jù)認為LAB法比ABC法敏感24倍，而LsAB法因鏈霉卵白素不與組織細胞中內源性生物素結合而特異性更高。現(xiàn)在SP法已趨于取代ABC法而廣為應用。AB復合物酶標鏈卵白素Peroxi

17、daseBiotinAvidin-生物素化II抗I抗組織抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）抗原SP法示意圖（-）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）1）、切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯雖然可以反復使用，但次數(shù)不宜多。乙醇的濃度是從高到低，與脫水時相反。2）、滅活內源性酶：博士德推薦應用3%的雙氧水，但實際操作中，使用30%雙氧水和純甲醇按1:9的溶劑比混合較為理想。3）、抗原修復：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。III4）、正常山羊血清封閉：封閉時應該注意室溫與時間的相對III前功盡棄。后面的步驟也是關系。室溫低，時間就要長一些，反之亦然。另外，保持反應池濕潤是重要的一環(huán)，否則，孵育時間和溫

18、度與染色強度陽性染色強度不夠時，可提如此。5）、一抗反應：一抗的稀釋度、與背景有直接關系。一般說來，高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時則相反。孵育時間與溫度：抗原抗體充分反應是得到可靠結果的關鍵。因此，控制溫度與時間也是一個嚴肅的問題。由于室溫控制較為困難，建議4C冰箱過夜Q18h）o6）、二抗（生物素化IgG）反應：建議濕盒內37Clh,另外儀器顯示溫度37C,但實際只有23C,自然結果難以令人滿意。7）、SABC染色（37C）:這是博士德的人性化之處，直接就可以用。8）、DAB顯色鏡下控時：DAB濃度應該比推薦的要低一些，這樣可以便于控制反應時間以及在合適的時候中止反應。同時注使用后殘余

19、的DAB應妥善處理，而不是隨便倒入下水道，因為它有致癌性。9）、蘇木素輕度復染：不建議使用。盡管復染后標本層次分明,但實際情況是，這樣有時也會掩蓋陽性結果，從而使前功盡棄。10）、脫水透明：脫水乙醇的濃度由低到高，有一個較準確判斷脫水成功與否的辦法是：觀察透明后盛二甲苯容器的壁，若發(fā)現(xiàn)白色霧狀現(xiàn)象，則說明脫水不成功，應再次脫水。透明時間不要太長，1分鐘左右就可以了。11）、封片：封片時，中性樹脂量宜少，同時注意不要產生氣泡。（三）免疫組化染色基本技術及注意事項實驗計劃根據(jù)課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如AbI鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動物，而且AbII必須是羊抗鼠，若PAP法AbIH必須來源于鼠，否則不能連接成復合物若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無可比性。選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。Ab稀釋度(如系購買的藥盒有工作液和原液)工作液：無須稀釋原液：應參照其提供的工作液濃度進行預試驗原液的保存(-20C)凍存若工作濃度大于1：500則要先將