臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)：第八章 熒光免疫技術(shù)

1、第八章 熒光免疫技術(shù)Immunofluorescence Technique熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種免疫分析技術(shù)。 Coons等于1941年首次采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體，檢測小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原而獲得成功。1970年后發(fā)展建立起了熒光免疫測定技術(shù)(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)。近年來，熒光免疫技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、定量化和自動(dòng)化階段。熒光免疫技術(shù)分為兩大類:熒光抗體染色技術(shù)熒光免疫測定 熒光抗體染色技術(shù)是用熒光抗體對(duì)細(xì)胞、組織切片或其他標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行鑒定和定位檢測，可在熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)

2、果，稱為熒光免疫顯微技術(shù)，或是應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行自動(dòng)分析檢測，稱為流式熒光免疫技術(shù)；第一節(jié) 熒光標(biāo)記物的制備一、熒光和熒光物質(zhì)二、熒光標(biāo)記物的制備(一) 熒光1熒光的產(chǎn)生: 一些化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量(如光能、化學(xué)能)而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)至基態(tài)時(shí)，過剩的能量以熒光形式釋放出來。光致熒光化學(xué)熒光X線熒光或陰極射線熒光。e電子熒光高能級(jí)基態(tài)激發(fā)態(tài)2熒光效率 熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率。熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，而是或多或少地以其他形式釋放。3. 熒光壽命 指熒光物質(zhì)被一瞬時(shí)光脈沖激發(fā)后產(chǎn)生的熒光隨時(shí)間而衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。4熒光的

3、淬滅 指熒光分子的輻射能力受到激發(fā)光較長時(shí)間的照射后會(huì)減弱的現(xiàn)象。這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光形式發(fā)射所致。5影響因素 (1)pH (2)溫度(3)熒光素的濃度 (4)雜質(zhì)對(duì)細(xì)胞熒光染色的影響 (5)某些細(xì)胞固定劑對(duì)細(xì)胞熒光染色的影響 (6)苯胺、酚、硝基苯及一些鹵化物影響 (二)熒光物質(zhì)1常見熒光素(1)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC) (2)四乙基羅丹明(rhodamine,RB200) (3)四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) (4)

4、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE) 2其他熒光物質(zhì)(1)鑭系稀土元素 (2)酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì) 二、熒光標(biāo)記物的制備(一)熒光素標(biāo)記物的制備1熒光素標(biāo)記抗體的方法2熒光素標(biāo)記抗體的純化3熒光素標(biāo)記抗體的鑒定(二)鑭系稀土元素標(biāo)記物的制備第二節(jié) 熒光免疫顯微技術(shù)Immunofluorescent Microscopy Technique一、基本原理熒光免疫顯微技術(shù)是以熒光顯微鏡為檢測工具，用熒光素標(biāo)記特異性抗體或抗抗體，檢測固定組織細(xì)胞上的抗原或血清中的抗體，常用于定性和定位檢查的一門技術(shù)。二、技術(shù)類型根據(jù)標(biāo)記物和反應(yīng)程序的不同，可將熒光免疫顯微技術(shù)分為直接法、間接法、補(bǔ)體結(jié)合法和

5、雙標(biāo)記法等四類。1直接法用熒光素標(biāo)記特異性抗體，將特異性熒光抗體直接滴加于待測標(biāo)本上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)(圖18-1)。此法常用于細(xì)菌和病毒等病原微生物的快速檢測、腎活檢及皮膚活檢的免疫病理檢查。2間接法用熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體(抗抗體)，待基質(zhì)標(biāo)本中的抗原與相應(yīng)抗體(第一抗體)反應(yīng)，再用熒光素標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)結(jié)合第一抗體，通過熒光現(xiàn)象檢查抗原或抗體(圖18-2)。此法常用于檢測各種自身抗體。3補(bǔ)體結(jié)合法用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，待基質(zhì)標(biāo)本中的抗原與抗體反應(yīng)后，加入補(bǔ)體，補(bǔ)體和抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，再加入熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體，通過熒光現(xiàn)象檢查抗原或抗體(圖18-3)。4雙標(biāo)記法用兩種熒光

6、素 (FITC和RB200) 分別標(biāo)記不同抗體，對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，若有相應(yīng)的兩種抗原同時(shí)存在，在熒光顯微鏡下用兩種不同的激發(fā)光，同時(shí)顯示兩種熒光(黃綠色和橘紅色熒光)，方法與直接法相同。本法主要用于同時(shí)觀察細(xì)胞表面兩種抗原的分布與消長關(guān)系，區(qū)分末梢血或同一切片中T和B細(xì)胞等。三、技術(shù)要點(diǎn) 熒光免疫顯微技術(shù)主要包括標(biāo)本的制作、熒光抗體染色和熒光顯微鏡檢查等步驟:(一)標(biāo)本的制作(二)熒光抗體染色(三)熒光顯微鏡檢查 (一) 標(biāo)本的制作在制備標(biāo)本過程中，應(yīng)力求保持抗原的完整性。在染色和洗滌等過程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至臨近細(xì)胞或組織間隙中去。 常見的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三

7、大類 。涂片、印片或切片 。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本片應(yīng)在染色前以適當(dāng)方式固定 (二) 熒光抗體染色在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，置帶蓋的濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時(shí)間，一般以2537溫育30min。不耐熱抗原的檢測則以4過夜為宜。溫育后充分洗滌干燥。(三) 熒光顯微鏡檢查 經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當(dāng)天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果。熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風(fēng)良好的暗室內(nèi)進(jìn)行。 熒光顯微鏡與普通顯微鏡的不同之處在于光源、濾光片、聚光器及鏡頭等。注意事項(xiàng) 1.非特異性熒光染色是直接影響檢測結(jié)果的主要問題。 2.對(duì)照：陽性對(duì)照即為已知的陽性對(duì)照。陰性對(duì)照包括

8、：用與特異性抗體種屬相同的動(dòng)物血清或同一動(dòng)物免疫前的血清標(biāo)記熒光素代替特異性抗體，結(jié)果應(yīng)為陰性。染色抑制試驗(yàn)：將未標(biāo)記熒光素的抗體先與切片的靶抗原反應(yīng)，然后再加熒光素標(biāo)記的相同抗體，結(jié)果應(yīng)為弱陽性或陰性。用PBS代替熒光抗體，結(jié)果應(yīng)為陰性。標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照，即切片標(biāo)本經(jīng)PBS洗后不加熒光抗體，應(yīng)為陰性。四、方法評(píng)價(jià)熒光免疫顯微技術(shù)可用于組織學(xué)中抗原或抗體的定位、定性檢查，既有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強(qiáng)。其缺點(diǎn)是熒光容易消退，難以制備永久性標(biāo)本，非特異熒光的干擾常影響結(jié)果的判斷。五、臨床應(yīng)用 熒光免疫顯微技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中已用作細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)及

9、自身免疫病的診斷等1血清中自身抗體的檢測 2各種微生物的快速檢查和鑒定 3寄生蟲感染的診斷 4白細(xì)胞分化抗原的檢測 5. 人類白細(xì)胞抗原(HLA)、腫瘤組織中腫瘤抗原、組織中免疫球蛋白和補(bǔ)體組分、激素和酶的組織定位等的檢測。第三節(jié) 熒光免疫測定技術(shù) fluorescence immunoassay Technique1.非均相熒光免疫測定法：時(shí)間分辨熒光免疫測定(time-resolved fluorescence immunoassay, TR-FIA)熒光酶免疫測定(fluorescence enzyme immunoassay，F(xiàn)EIA)。2.均相熒光免疫測定法：熒光偏振免疫測定(flu

10、orescence polarization immunoassay,FPIA)底物標(biāo)記熒光免疫測定(substrate-labeled fluorescent immunoassay，SLFIA)一、時(shí)間分辨熒光免疫測定 基本原理 技術(shù)類型 技術(shù)要點(diǎn) 方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用 (一)、基本原理時(shí)間分辨熒光免疫測定是用鑭系稀土元素螯合物(如Eu 3+螯合物)標(biāo)記抗體或抗原，檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原或抗體。此螯合物具有較長熒光壽命，利用時(shí)間分辨熒光分析儀延緩測量時(shí)間，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號(hào)完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。另一個(gè)特點(diǎn)是激發(fā)光與熒光的波長差別顯著，其波長轉(zhuǎn)變達(dá)270nm，

11、可有效排除激發(fā)光的干擾，測得的熒光為稀土元素螯合物發(fā)出的特異性熒光信號(hào)(圖18-4)。(二)、技術(shù)類型1固相雙位點(diǎn)夾心法 2固相抗原競爭法 3固相抗體競爭法 1固相雙位點(diǎn)夾心法使用針對(duì)抗原不同決定簇的兩種特異性抗體，一種包被在固相上，另一種用Eu3+標(biāo)記。標(biāo)準(zhǔn)品或待測抗原先與固相抗體反應(yīng)，洗滌后再加入Eu3+標(biāo)記的抗體，再次溫育，形成固相抗體-抗原- Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，充分洗滌后加入增強(qiáng)液，測定熒光強(qiáng)度，所測得的熒光強(qiáng)度與待測抗原濃度成正比(圖18-5)。 2固相抗原競爭法將大分子抗原直接（或小分子半抗原通過化學(xué)偶聯(lián)法制成半抗原-蛋白質(zhì)結(jié)合物）包被在固相上，成為固相抗原。待測抗原和固相抗

12、原競爭結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，標(biāo)本中待測抗原濃度越高，則Eu3+標(biāo)記抗體結(jié)合到固相上的量越少，因此所測得的熒光強(qiáng)度與標(biāo)本中待測抗原濃度成反比。3固相抗體競爭法待測標(biāo)本中抗原和Eu3+標(biāo)記的抗原與固相抗體(特異性抗體包被固相)發(fā)生競爭結(jié)合, 溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測定熒光強(qiáng)度，所測得的熒光強(qiáng)度與待測抗原含量成反比。目前為了生產(chǎn)試劑盒的方便，常用抗抗體(Ab2)包被固相，這種固相抗抗體實(shí)際上是一種通用的分離劑，分離Eu3+標(biāo)記抗原和Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。(三)、技術(shù)要點(diǎn)以固相雙位點(diǎn)夾心法檢測(alpha-fetoprotein、AFP)為例。以抗人AFP多克隆抗體包被聚苯乙烯

13、微量滴定條或珠，加入不同濃度的AFP標(biāo)準(zhǔn)品和待測血清，加入緩沖液反應(yīng)46h。洗滌后，加入生物素化抗人AFP單克隆抗體，振蕩溫育反應(yīng)46h。洗滌后，加入Eu3+標(biāo)記的鏈霉親和素，振蕩反應(yīng)1h。洗滌后，加入增強(qiáng)液，快速振蕩15min，放置15min后在時(shí)間分辨熒光分析儀上測量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出待測血清中AFP濃度。(四)、方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用TR-FIA方法特異性強(qiáng)，靈敏度高(可達(dá)0.21ng/ml)。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬 (跨越45個(gè)數(shù)量級(jí))。分析速度快。標(biāo)記物制備較簡便、有效使用期長，無放射性污染。檢測項(xiàng)目多：各種激素(肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等)、蛋白質(zhì)、酶、藥物、腫瘤標(biāo)記物和病毒抗原等

14、。二、熒光偏振免疫測定基本原理技術(shù)要點(diǎn)方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用(一)、基本原理熒光偏振免疫測定是利用熒光素經(jīng)偏振光照射而躍入激發(fā)態(tài)，在回復(fù)至基態(tài)后可釋出光子，經(jīng)偏振儀形成偏振熒光，熒光偏振強(qiáng)度與熒光分子的大小成正比的關(guān)系而建立的免疫分析技術(shù)。 FPIA是一種均相競爭熒光免疫分析法。其原理：待測的小分子抗原和熒光素標(biāo)記的小分子抗原(恒定量)與相應(yīng)抗體(恒定量)競爭結(jié)合。當(dāng)待測的小分子抗原濃度高時(shí)，經(jīng)過競爭反應(yīng)，大部分抗體被其結(jié)合。而熒光素標(biāo)記的小分子抗原多呈游離狀態(tài)，因其分子小，在液相中轉(zhuǎn)動(dòng)速度較快，測量到的熒光偏振強(qiáng)度也較低。反之，如待測的小分子抗原濃度低時(shí)，大部分熒光素標(biāo)記的小分子抗原與抗體結(jié)合，

15、形成大分子的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，此時(shí)檢測到的熒光偏振強(qiáng)度也較高，即熒光偏振強(qiáng)度與待測小分子抗原濃度呈反比(圖18-6)。通過小分子抗原標(biāo)準(zhǔn)品與熒光偏振強(qiáng)度關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可檢測小分子抗原的濃度。(二)、技術(shù)要點(diǎn) 以環(huán)孢素測定為例。1標(biāo)本的預(yù)處理 取待檢全血，加入溶解劑和蛋白沉淀劑，混勻后離心，上清待用。2抗原抗體反應(yīng) 在反應(yīng)管中分別加入一定量的預(yù)處理標(biāo)本上清、熒光素標(biāo)記的環(huán)孢素、抗環(huán)孢素單克隆抗體及反應(yīng)緩沖液進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。3偏振熒光強(qiáng)度測定 抗原抗體反應(yīng)開始時(shí)，立即用熒光偏振免疫分析儀測定其空白偏振熒光強(qiáng)度(P1)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)再測定其偏振熒光強(qiáng)度(P2)，根據(jù)待測標(biāo)本的偏振熒光強(qiáng)度P(P2-P1)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接計(jì)算出所測物質(zhì)的含量。(三)、方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用FPIA方法具有下述優(yōu)點(diǎn)：均相測定方法簡便，易于快速、自動(dòng)化進(jìn)行。熒光標(biāo)記試劑穩(wěn)定、有效期長，并使測定的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果可靠。可用空白校正