限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3課件

1、第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶第二節(jié) DNA連接酶第三節(jié) DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié) DNA修飾酶第五節(jié) 外切核酸酶第六節(jié) 單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié) RNA酶核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶?；靖拍罴捌渖锕δ芴禺愃鈹嗔裄NA分子，核糖核酸酶（RNase）特異水解斷裂DNA分子，脫氧核糖核酸酶（DNase）非專一性酶，底物或者為DNA或者為RNA從核酸分子末端逐個降解核苷酸，叫外切核酸酶從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑危袃?nèi)切核酸酶 按水解斷裂核酸分子的方式: 根據(jù)作用的核酸底物不同:基因工程的操

2、作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。 工具酶 1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化作用 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切核酸酶(Restriction endonuclease)是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。 限制性核酸內(nèi)切酶概念2. 性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切

3、口的酶。形成5-P和3-OH末端 自我保護(hù)作用3. 功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1. 來源任何一種生物體都存在防御外界物質(zhì)進(jìn)入的機(jī)制大腸桿菌B大腸桿菌Kphage (B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修飾作用）修飾的phage (K) 人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。 細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。 寄主的限制與修飾現(xiàn)象E.O.P 成斑率efficiency of platingEOP=1 限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源

4、DNA進(jìn)行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction） 限制作用:實際就是限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。 細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（Modification） Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基 修飾作用:宿主細(xì)胞通過甲基化作用達(dá)到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。（3）限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個基因 hsd R:

5、 編碼限制性內(nèi)切酶 hsd M: 編碼限制性甲基化酶 hsd S: 編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)這類酶能識別DNA分子上的特定位點，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點上的堿基甲基化，即起修飾 DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識別特殊的作用位點。2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，B株 中， 1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù). 2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識別位點-（修飾）1.大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。限制和修飾作用的分子機(jī)制3. 外來DNA入侵時，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解 -（限制）4. 由于降

6、解不完全，外來少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。 5接受了新宿主菌甲基化修飾的同時，喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記，喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力。基因工程中，應(yīng)采用缺少限制作用的菌株作為受體。1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化作用 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶1973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱

7、。大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示2. 如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如 Hind ：d菌株 EcoR I ：抗藥性R質(zhì)粒 3. 如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。 如Hind ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個酶4. 所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如 R.Hind 表示限制性內(nèi)

8、切酶 M.Hind 表示相應(yīng)的甲基化酶實際應(yīng)用中，R常被省略。 EcoR IEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號 若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。 目前鑒定出四種不同類型的限制性內(nèi)切酶。據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型。 限制性內(nèi)切酶的類型二、限制性內(nèi)切酶的類型 據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型。 主要特性型型型限制修飾 蛋白結(jié)構(gòu) 輔助因子 識別序列 切割位點雙功能（具甲基化） 異源三聚體 ATP Mg2+ SAM 距識別序列1kb處 隨機(jī)性切割單一功能 同源二聚體

9、Mg2+ 4-6bp回文序列 識別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能（具甲基化） 異源二聚體 ATP Mg2+ 距識別序列下游24-26bp處 隨機(jī)性切割基因工程中使用注： SAM為S腺苷甲硫氨酸首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的。（1）識別位點序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC型限制性內(nèi)切酶的基本特性 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修飾的特異序列。N：表示任何一種核苷酸需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子在距離特異性識別位點約10001500 bp處隨機(jī)切開一條單鏈，不產(chǎn)生特異片斷，應(yīng)用

10、不大Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位點 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。 分離的第一個酶是Hind 未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與DNA的來源無關(guān)。 A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A 或型限制性內(nèi)切酶的基本特性 （1）識別位點序列 識別位點處。 切開雙鏈DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齊末端（blunt end）。如： EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GA

11、CGTC-5 產(chǎn)生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 產(chǎn)生平齊末端 （2）切割位點A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位點核酸內(nèi)切酶Hind對雙鏈DNA分子的切割作用 在完全肯定的位點切割DNA(識別位點下游24-26bp)，但不是對稱的回文順序，且在識別序列旁邊一定數(shù)目核苷酸的位置切割。 反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 IV型限制性內(nèi)

12、切酶 新鑒定出來的一類限制酶。只切割堿基已被甲基化、羥甲基化、葡糖羥甲基化的DNA序列。 除EcoKMcrBC外，識別序列尚未確定，目前尚無應(yīng)用。核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性I型內(nèi)切酶II型內(nèi)切酶III型內(nèi)切酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，旋轉(zhuǎn)對稱 （IIs型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG切割位點在距離識別位點至少1000 bp外隨機(jī)切開一條單鏈。位于

13、寄主特異性位點或其附近識別位點3端24-26bp處甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是不是基因工程中的用途無用十分有用用處不大1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化作用 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶識別序列 識別順序的堿基數(shù)一般為4-6 bp，少數(shù)識別更長，多數(shù)識別位點具有旋轉(zhuǎn)對稱性（回文結(jié)構(gòu)），少數(shù)的識別位點在切割位點之外，具旋轉(zhuǎn)對稱性。 4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bpAva G GWCC E

14、coR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 1、以某一對核苷酸為中軸，左右同數(shù)目的核苷酸彼此呈堿基互補(bǔ)。2、這兩股DNA鏈若按同方向閱讀（如5 3），其核苷酸順序相同。 5GAA TTC3 3CTT AAG5特點有二：回文序列：反向重復(fù)序列，雙鏈DNA中含有兩個結(jié)構(gòu)相同，方向相反的序列 5GTNAC3 3CANTG5限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3 位酯鍵產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5-P和3-OH，產(chǎn)生3種不同的切口。 切割方式 與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概

15、念粘性末端(cohesive ends):因酶切位點在兩條DNA單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個粘性末端很容易通過互補(bǔ)堿基的配對而重新連接起來。平 末 端(Blunt end): 因酶切位點在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易重新連接起來。1. 5突出的末端EcoRI等產(chǎn)生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-AP OH-G-C-T-C 5

16、 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 52. 3突出的末端PstI等產(chǎn)生的3粘性末端 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OH P-G 3 3G- P OH -A-C-G-T-C 5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易得多。粘性末端的意義 連接便利ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。粘性末端可以用DNA聚

17、合酶補(bǔ)平成平齊末端。 補(bǔ)平成平齊末端B 3末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A 5末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。 末端標(biāo)記3. 平頭末端PvuII等產(chǎn)生的平頭末端 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5平齊末端的特點 連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接效率的1%，這種連接常出現(xiàn)多聯(lián)體連接。粘性末端與平齊末端連接

18、的處理方法）添補(bǔ)法： 利用DNA聚合酶 (klenow fragment）將堿基添補(bǔ)到目的基因的粘性末端上。）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端不同來源的酶，識別相同的序列，切割方式相同或不同。識別位點和切點完全相同 如Hind 和Hsu IHind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 同裂酶（Isoschizomer) 完全同裂酶：Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5識別位點相同，但切點不同。如X

19、ma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。 同尾酶(Isocaudamers）5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。5-G3-CCTAGGATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-

20、CCTAGA-5BamH IBgl Sau 3A1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化作用 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶1. 標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立 一個單位（U）的限制性內(nèi)切酶定義： 在合適的溫度和緩沖液中，在20l的反應(yīng)體系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。推薦：稍過量的酶（2-5倍）和較長的反應(yīng)時間 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 2. 酶解過程 配酶解體系 混勻 反應(yīng)終止 酶解結(jié)果鑒定 酶解體系一般20l，保證酶液體積不超過反應(yīng)總體積的10%前提下，盡量降低反應(yīng)總體積。加樣順序一般是：

21、ddH2O buffer DNA 酶 大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低鹽酶100 mM 中鹽酶150 mM 高鹽酶Volume20 - 100 mlTime Temp37 1 - 1.5 hr 混勻移液槍吹打或手指輕彈管壁若底物分子很大（如基因組DNA），應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩。混勻后微量高速離心機(jī)進(jìn)行短暫離心，使管壁液體全部下沉。反應(yīng)終止三種方法：）加乙二胺四乙酸（EDTA）至終濃度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸鈉（SDS） 至終濃度0.1%(W/V)）65加

22、熱20min或者70加熱10min）酚/氯仿抽提 酶解結(jié)果鑒定快速進(jìn)行微型瓊脂糖凝膠電泳觀察然后決定是否終止反應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 完全消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。 局部消化：只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。 通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。 酶切后發(fā)現(xiàn)除了目的DNA條帶外，還有其它條帶造成非特異性切割；不正確的操作，導(dǎo)致其它內(nèi)切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。電泳后電泳條帶擴(kuò)散，電泳條帶移動距離異常 底物DNA不純；內(nèi)切酶不純；酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起使電泳條帶移動距離異常 DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、苯

23、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都會影響酶的活性。 1. DNA的純度 一般采取 純化DNA 加大酶的用量 （510U酶/ g DNA ） 延長保溫時間 （34h） 擴(kuò)大反應(yīng)體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌♂專?20 l） 加入亞精胺提高消化作用，需要適當(dāng)?shù)臏囟?影響限制性內(nèi)切酶活性的因素 2. DNA的甲基化程度 大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。 基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。 不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 ，少數(shù)例外。酶最適溫度酶最適溫度酶最適溫度Apa I Bcl

24、 I Mae II Taq I30 50 50 65Apy I BstE II Mae III30 60 55Ban I Mae I Sma I50 45 253. 溫度 酶切超螺旋DNA分子，所需酶量多于線性DNA分子；最高可達(dá)20倍；4. DNA分子的構(gòu)型 對同一DNA分子上不同位置的識別序列，切割效率具有位點偏愛性； 識別序列的側(cè)面序列影響酶切效率。 “保 護(hù) 堿 基”是影響限制酶活性的重要因素。5. 緩沖液(Buffer) 緩沖液的化學(xué)組成：10XbufferMgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度； Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）： 防止酶的氧化，

25、保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等： 提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止酶失活 ；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性” （star activity）現(xiàn)象。 EcoRI*代表EcoRI的星號活力。 星活性的特點: 限制酶識別序列特異性降低 商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。 EcoR I 和BamH I 等都有*活性。EcoR I *在低鹽、高pH（8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：使用的時候要特別注意！概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：（1）高甘油含量（5, vv）；（2）限制性內(nèi)切核酸酶用量過高（100UugDNA）；（3）低離子濃度（25 mmolL）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含有機(jī)溶劑，如DMSO（二甲基亞砜 ），乙醇等；（6）有非Mg2+的二價陽離子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。 但在實際應(yīng)用中，一般要用稍過量的酶（1g加25U酶）反應(yīng)較長的時間，才能達(dá)到完全酶解。但是不能過分加大酶的用量酶過量對酶切反應(yīng)的影響：1）酶過量（一般為100U/gDNA）會影響識別序列的正確性，如