青蒿琥酯治療對斯氏貍殖吸蟲病大鼠血清IL-2和IL-4含量的影響

1、青蒿琥酯治療對斯氏貍殖吸蟲病大鼠血清IL-2和IL-4含量的影響李鵬華1* 黃玉清2 暢靈麗1王敏1 佘俊萍1 張金平1王光西1基金項目: 四川省衛(wèi)生廳科研基金（NO. 100232）作者單位：646000瀘州，1瀘州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，2瀘州醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生科通信作者：王光西，Email: HYPERLINK mailto: *現(xiàn)在遼寧省朝陽市中心醫(yī)院ICU工作。摘要 目的：對比觀察青蒿琥酯(Art)和吡喹酮治療大鼠斯氏貍殖吸蟲病后，大鼠免疫轉(zhuǎn)歸情況,了解青蒿琥酯是否有提高斯氏貍殖吸蟲病大鼠免疫力的作用。方法：將36只清潔級雄性Wistar大鼠隨機分成6組，其中5組每只鼠腹腔注射斯氏貍殖吸蟲囊

2、蚴25個，于感染后30天開始用藥治療，治療組分別給予Ar50/（d）、Ar100/（d）、Ar150/（d）,連續(xù)給藥7天，吡喹酮組150/隔日給藥一次，共3次。模型對照組不做治療。另設(shè)正常對照組。于用藥30天后，摘取大鼠眼球取血,分離血清,用ELISA測定大鼠血清中的細胞因子白細胞介素-2（IL-2）和白細胞介素-4（IL-4）的含量，解剖大鼠，取脾臟稱重，計算脾臟指數(shù)，來觀察青蒿琥酯對大鼠免疫功能的影響。結(jié)果: Art50/（d）組、Art100/（d）組與模型對照組比較，大鼠血清中IL-2、IL-4 含量有顯著性差異（P0.05），與正常對照組相比無顯著性差異（P0.05）； Art15

3、0/（d）組大鼠血清中IL-2、IL-4 含量與模型對照組相比無差顯著性差異（P0.05），吡喹酮組與正常對照組比較，血清中IL-2及IL-4的變化有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：中、低劑量的青蒿琥酯有提高斯氏貍殖吸蟲病大鼠免疫力的作用。關(guān)鍵詞：斯氏貍殖吸蟲；青蒿琥酯；白細胞介素-2;白細胞介素-4.Efects of Artesunate on IL-2 and IL-4 in the serum of rats Infected with Pagumogonimus skrjabini LI Peng-hua，Chang Ling-li, Huang Yu-qing, Wang Min,

4、 She Jun-ping, Zhang Jin-ping, Wang Guang-xiCorresponding author：Wang Guang-xi Supported by Research Foundation of Sichuan Health Department （NO. 100232）【Abstract】Objective To observe the effects of Artesunate(ART) on IL-2 and IL-4 in the serum of rats Infected with Pagumogonimus skrjabini.Methods M

5、ale Wistar rats weighting 200-250 g were selected for experiment30 wistar rats were intra-abdominally injected with 25 metacercarias and randomly divided into 5 groups. 6 normal Wistar rats were randomly selected as control group30days after the rats were infected with the metacercaria of Pagumogoni

6、mus skrjabini,the intragastric administration was performed according to Art 50/(d) 、Art100/(d) 、Art 150/(d), for consecutive 7days, Praziquantel 150/,qod,3times.Model control group not treated. Orbital blood was collected for qualification of of IL-2 and IL-4 which were detected in serum by ELISA.

7、Results: The serum level of IL-2and IL-4 of rats in Art50/(d) and Art100/(d) groups, compared with the normal group , there were no significant difference (P0.05). Compared with the normal group , there was no significant difference between the Art150/（d） group and the disease model group about the

8、serum level of IL-2and IL-4 . The serum level of IL-2 and IL-4 of rats in Praziquantel group，compared with the normal group , there were significant difference ( P0.05). Conclusions: Low dose and In dose Art can enhanced the immunity of the rats infected with Pagumogonimus skrjabini.Key Words: Pagum

9、ogonimus skrjabini; Artesunate; IL-2; IL-4. 斯氏貍殖吸蟲為我國獨有蟲種，分布于四川、云南、貴州、湖南、湖北、廣西、廣東等14個省市自治區(qū)。該蟲的終末宿主是果子貍、犬、貓，人因生食、半生食溪蟹感染，人是斯氏貍殖吸蟲的非正常宿主，該蟲在人體內(nèi)處于童蟲狀態(tài)，到處游竄，造成某些器官或全身損害， 出現(xiàn)幼蟲移行癥。該蟲引起的幼蟲移行癥可分為兩種類型：皮膚型與內(nèi)臟型。皮膚型幼蟲移行癥主要表現(xiàn)為游走性皮下包塊或結(jié)節(jié)；內(nèi)臟型幼蟲移行癥則因侵犯器官不同而出現(xiàn)不同損害及表現(xiàn)，如侵犯肝，則出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、肝大、轉(zhuǎn)氨酶升高、白/球蛋白比例倒置、球蛋白升高等表現(xiàn)1。寄生蟲感染一般

10、有宿主特異性，多數(shù)引起慢性感染。在慢性感染過程中，免疫反應(yīng)的類型也會發(fā)生變化，且受循環(huán)抗原和局部持續(xù)性抗原的刺激及形成的不同免疫復(fù)合物的沉積等因素的影響，常常存在免疫抑制及免疫病理反應(yīng)。因此，宿主抗寄生蟲的免疫防御具有多種效應(yīng)機制， T細胞是抗寄生蟲免疫機制的基礎(chǔ) 2 。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯具有抗多種病原微生物及免疫抑制作用，其免疫抑制作用主要通過：增強效應(yīng)階段Ts的活性 、抑制郎格罕細胞、抑制NK細胞的活性、抑制IL-1及IL-2活性、降低血清溶菌酶水平 、降低血清IgG含量等多種途徑實現(xiàn)3。研究表明青蒿琥酯對大鼠體內(nèi)的衛(wèi)氏并殖吸蟲和斯氏貍殖吸蟲均有有一定的殺滅效果4，5 ，本研

11、究擬在前期觀察青蒿琥酯對大鼠斯氏貍殖吸蟲治療效果基礎(chǔ)上，進一步觀察青蒿琥酯治療對斯氏貍殖吸蟲病大鼠血清IL-2和IL-4含量的影響以及脾臟重量變化，探討青蒿琥酯治療對斯氏貍殖吸蟲病大鼠免疫轉(zhuǎn)歸情況的影響，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1材料與方法1.1 實驗材料與儀器1.1.1實驗動物選擇雄性Wistar大鼠36只，體重200250g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物感染前連續(xù)檢查糞便3天，并殖吸蟲卵陰性及健康狀況良好者為合格實驗動物。11.2 主要實驗試劑青蒿琥酯片由桂林南藥股份有限公司提供，批號070602；吡喹酮片由南京制藥有限公司提供，批號20061206；IL-2 ELISA試劑盒、IL

12、-4 ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。1. 1.3 主要實驗儀器 臺式高速離心機（TGL.16G） 電子天平（賽多利斯） 酶標儀（ELX800型，BioTek公司）12 實驗方法121 斯氏貍殖吸蟲感染大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕?211 斯氏貍殖吸蟲囊蚴的分離 從四川省宜賓市興文縣仙峰鎮(zhèn)采集的溪蟹中分離。將溪蟹逐只搗碎，取搗碎物放入錐形量杯中經(jīng)反復(fù)水洗自然沉淀至上液清亮為止，收集沉淀在解剖鏡下分離斯氏貍殖吸蟲囊蚴。12.1.2實驗動物分組將大鼠隨機分為6組，每組6只，分別為青蒿琥酯低劑量組50（.d）、青蒿琥酯中劑量組100（.d）、青蒿琥酯高劑量組150（.d）、吡喹酮組150（.d

13、）、正常組對照組，模型組對照組。12.1.3動物感染實驗組大鼠以斯氏貍殖吸蟲囊蚴25個/只經(jīng)腹腔注射感染，正常對照組大鼠不感染。1.3治療與觀察指標1.3.1 治療于大鼠感染30天后開始用藥治療。第一組為青蒿琥酯低劑量組50（d）、第二組為青蒿琥酯中劑量組100（d）、第三組為青蒿琥酯高劑量組150（d），經(jīng)口灌服，連續(xù)給藥7天；第四組為吡喹酮150，經(jīng)口灌服，隔日給藥一次， 共3次；第五組為模型對照組，給予同體積生理鹽水，第六組為正常對照組不做任何處理。青蒿琥酯和吡喹酮均用5%的NaHC03稀釋，再用生理鹽水配成所需濃度溶液。于用藥30天后，大鼠治療30天后，摘眼球取血（1-2ml）,離心取

14、血清，-20保存?zhèn)溆?，稱取大鼠重量，剖檢所有大鼠，取脾臟稱重并計算脾臟指數(shù)。1.3.2 觀察指標（1）脾臟指數(shù)的計算：脾臟指數(shù)=脾臟重（g）/體重（g）1000。（2）大鼠血清中IL-2、IL-4的測定：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測，均按操作說明書進行測定，于450 nm波長讀取吸光值(OD值)，所測數(shù)據(jù)減去實驗本底后，根據(jù)預(yù)先做好的標準曲線計算標本中IL-2、IL-4的濃度 (pg/ml)。1.4統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)代入SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差(xs)表示,組間比較采用單因素方差分析,P 0.05為有顯著性差異。2 結(jié) 果2.1 大鼠脾臟指數(shù)的變化：模型對照組與正常組

15、相比脾指數(shù)顯著升高（P 0.05），經(jīng)治療后，青蒿琥酯50（.d）組、青蒿琥酯100（.d）組、吡喹酮組脾臟指數(shù)顯著降低，與正常組對照組比較無顯著性差異（P 0.05）。（表1）表1 青蒿琥酯(Art)治療大鼠斯氏貍殖吸蟲后脾臟指數(shù)的變化 Table 1 The Changes of Spleen idex of rats infected with Pagumogonimus skrijabini rats after treatment with Art 組別 例數(shù) 脾指數(shù) Group Case Spleen index(xs) 正常對照組 6 2.73330.16330模型對照組 6 3

16、.83330.25033Art50（.d） 6 2.80000.34059 Art100（.d） 6 2.76670.24221Art150 6 3.43330.50067P 150 6 2.60000.24495 與模型對照組相比 P0.05; 與正常對照組相比P0.05 vs model P0.05; vs normal P0.052.2青蒿琥酯對斯氏貍殖吸蟲病大鼠血清中IL-2和IL-4含量的影響:模型對照組與正常對照組相比血清中IL-2含量顯著降低(P0.05),經(jīng)以上藥物治療后，以青蒿琥酯50（.d）、青蒿琥酯100（.d）組IL-2升高最為明顯,與正常對照組相比無顯著性差異(P0.

17、05);模型對照組與正常對照組相比血清中IL-4含量顯著升高,經(jīng)以上藥物治療后，以青蒿琥酯50（.d）、青蒿琥酯100（.d）組降低最為明顯,與正常對照組相比無顯著性差異(P0.05)；青蒿琥酯150（.d）組大鼠血清中IL-2和IL-4 含量與模型對照組比較無顯著性差異（P0.05）；吡喹酮150組大鼠血清中IL-2和IL-4含量與模型對照組比較有顯著性差異（P0.05），與正常對照組比較有顯著性差異（P0.05）表2。表2 青蒿琥酯對大鼠斯氏貍殖吸蟲血清中IL-2和IL-4含量的影響Table 2 The level of serum IL-2 and IL-4 in Rats infec

18、ted with Pagumogonimus skrijabini After treatment with Art 組別 例數(shù) IL-2(pgml) IL-4(pgml) Group No. Case正常對照組 6 28.33331.05409 4.11900.44537模型對照組 6 19.50000.76376 41.92930.80702Art50（.d） 6 26.66671.45297 4.23570.147790 Art100（.d） 6 28.33330.88192 3.9133O.15912Art150 6 19.16671.30171 39.43250.60501P 150

19、 6 27.0001.41421 4.27850.18568 F 13.498 1650.033 P 0.05 0.05 與模型對照組比P0.05 , 與模型對照組比P0.05,與正常對照組比P0.05 vs model P0.05, vs model P0.05 , vs normal P0.053 討 論有研究認為，青蒿琥酯抑制IL-2產(chǎn)生可能是其免疫抑制的重要機制，周平等觀察到青蒿琥酯能減輕正常小鼠胸腺重量，降低血清溶菌酶水平，增加紅細胞C3b受體花環(huán)率及抑制ConA誘導(dǎo)的脾細胞IL-2產(chǎn)生6。閻建忠等觀察了青蒿琥酯治療對約氏瘧原蟲感染小鼠特異性免疫建立的影響。采用DBA/2和BALB/

20、c小鼠經(jīng)腹腔感染約氏瘧原蟲后均分為三組:感染后未治療組、感染第3天和第6天青蒿琥酯治療組。認為對于約氏瘧原蟲初次感染免疫應(yīng)答能力不同的DBA/2和BALB/c小鼠,青蒿琥酯根治性治療不影響其特異性免疫的建立和免疫記憶性的維持7。張長城等用ELISA法檢測青蒿琥酯對滑膜細胞分泌IL-1和TNF-等炎癥因子的影響,青蒿琥酯各組滑膜細胞分泌IL-1和TNF-水平均明顯下降,青蒿琥酯能顯著抑制大鼠滑膜細胞的增殖，并能下調(diào)滑膜細胞分泌TNF和IL-1水平8。杜志峰等用青蒿琥酯80mg（kgd）連續(xù)灌胃給藥14d治療大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎，放射免疫分析法測量大鼠血清中TNF及IL-1含量。青蒿琥酯對大鼠佐劑性關(guān)

21、節(jié)炎具有良好治療作用，作用機制與其下調(diào)AA大鼠外周血TNF、IL1水平有關(guān)5。脾臟是機體重要的免疫器官，它的退化、萎縮或充血、增大都將影響免疫功能，尤其是體液免疫功能。在本實驗中，模型對照組與正常對照組相比，脾臟指數(shù)、IL-4明顯升高(P0.05)，提示模型對照組大鼠體液免疫亢進，從而造成以IgE合成增加，引起以超敏反應(yīng)為核心的免疫病理損傷。本實驗組大鼠經(jīng)Art50（.d）、Art100（.d）治療后，脾指數(shù)，IL-4降低，超敏反應(yīng)被抑制，免疫狀態(tài)有所改善。Art50（.d）、Art100（.d）治療組和正常對照組大鼠血清IL-2含量較模型對照組高（P0.05）,表明斯氏貍殖吸蟲病大鼠經(jīng)Art

22、治療后,大鼠免疫細胞的激活可促進機體體內(nèi)IL-2的分泌,參與宿主抗寄生蟲感染的保護性免疫應(yīng)答。Art50（.d）、Art100（.d）治療組大鼠血清IL-4含量下降，尤以Art100/最為明顯，這是由于IL-2含量升高，抑制Th2細胞分泌IL-4，IL-4水平降低提示體液免疫亢進引起的機體損傷得到減輕，同時也表明大鼠的體液免疫功能得到恢復(fù)。通過以上藥物對大鼠斯氏貍殖吸蟲病治療后細胞因子的變化提示，大鼠治療前是以Th2為主的免疫抑制狀態(tài)，隨著Art對斯氏貍殖吸蟲的殺傷和抑制作用，使宿主與寄生蟲的相互關(guān)系發(fā)生改變，Th2為主的免疫反應(yīng)減弱，Th1反應(yīng)有所增強，機體的保護性免疫有所恢復(fù)。在本實驗中，經(jīng)Art150/（. d）治療后的大鼠，脾臟指數(shù)的變化和血清中IL-2、IL-4