分子標記輔助選擇課件

1、第五章 分子標記遺傳標記分子標記分子標記在家畜育種的應用 第1頁，共47頁。 近10年來，分子遺傳學和分子生物學有了突飛猛進的發(fā)展，主要表現(xiàn)在：大量DNA水平上的分子遺傳標記及其檢測技術；DNA序列測定技術；轉基因技術；核移植（體細胞克?。┘夹g；第2頁，共47頁。大量的分子標記提供的信息可用于：QTL的檢測； 標記輔助選擇；標記輔助基因導入；標記輔助雜種優(yōu)勢利用；標記資源保存；研究品種起源與發(fā)展；親子鑒定；等等。研究最多第3頁，共47頁。第一節(jié)遺傳標記的概念概念：遺傳標記是指那些可準確鑒別的能反映個體特異性的遺傳特征，是一類與目標基因緊密連鎖，易于從表現(xiàn)型上直觀鑒別的等位基因。通過對標記性狀的

2、直接選擇，從而實現(xiàn)對目標基因的間接地選擇。第4頁，共47頁。理想的標記應具備： 高多態(tài)性，多態(tài)是指標記在群體中有多種基因型 ，多態(tài)程度高，個體之間在標記上就能表現(xiàn)出差異，所提供的信息也就越多； 數(shù)量多，而且均勻地覆蓋整個基因組； 對它的測定不受年齡、性別、環(huán)境等因素的限制； 共顯性，能夠準確判別所有可能的基因型。第5頁，共47頁。 傳統(tǒng)的標記有： 1、形態(tài)學標記：主要指一些具有鮮明外部特征的質量性狀，并可以通過表型來推斷其基因型，如毛色、有無犄角等； 2、細胞學標記：是指染色體形態(tài)、數(shù)目和結構的變異，用具有異常染色體的個體與具有正常染色體的個體雜交或用染色體替換等手段，可對一些基因進行定位；

3、3、生化標記：是在血液或乳中的蛋白質（包括酶）的多態(tài)性，這些多態(tài)性可通過免疫反應或電泳技術反映出來，并由此判定其基因型，如血型抗原、血液蛋白、乳蛋白、同工酶等。 傳統(tǒng)標記的主要缺陷：多態(tài)性和數(shù)量有限。第6頁，共47頁。 第二節(jié) 分子標記 （molecular marker） Botstein 限制性片段長度的多型性 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) VNTR (various number of tandem repeats)1985 K.B. Mullis 基于聚合酶鏈式反應的多型性 PCR-based polymorphsm19

4、96 E. Lander 單核苷酸多型性 SNP (single nucleotide polymorphism)第7頁，共47頁。全基因DNA測序是揭示DNA多型性的最清晰，最全面的方法，是研究基因功能，揭示生命奧秘的重要途徑 。開發(fā)RFLP及以PCR為基礎的分子標記技術，對目的基因進行分子標記的精細定位，并將分子標記應用于遺傳改良的輔助選擇中，仍是分子技術育種和現(xiàn)代農業(yè)體系中十分重要與有效的領域。第8頁，共47頁。分子標記具有明顯的優(yōu)越性：直接以DNA的形式表現(xiàn)，在各個組織、各發(fā)育時期均可檢測，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在是否表達的問題；數(shù)量多，遍及整個基因組，檢測位點近乎無限；多態(tài)性高，自

5、然存在著許多等位變異，不需要專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；表現(xiàn)為中性，即不影響目標形狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；共顯性。分子標記是傳統(tǒng)遺傳標記的補充和發(fā)展。第9頁，共47頁。RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms限制性酶切片段長度多態(tài)性，是指用限制性內切酶酶切不同個體的基因組DNA后，所得的含有同源序列的酶切片段在長度上所存在的差異。差異的產生是由于DNA序列中個別堿基的變異而造成某個限制性內切酶酶切位點的產生或丟失。最早開發(fā)的DNA標記。第10頁，共47頁。第11頁，共47頁。第12頁，共47頁。特點:無表型效應;共顯性雙親的兩個以上分子

6、量不同的多態(tài)性片段均在F1中表現(xiàn);種族特異性;標記范圍遍及全基因組;但所需DNA量大,檢測步驟繁瑣,檢測時間相對較長（一般需10-14天）,耗費成本高,需利用放射性同位素。 可將RFLP標記轉化為PCR-RFLP標記第13頁，共47頁。CAPs又稱PCR-RFLP即利用特定引物進行PCR擴增，將PCR產物用限制性內切酶酶切，檢測酶切片段大小差異，觀察其多態(tài)性。第14頁，共47頁。RAPDrandomly amplified polymorphic DNA-隨機擴增多態(tài)性DNA是基于PCR技術的分子標記，它是用隨機序列組成的寡核苷酸作為引物，通過專門的PCR反應擴增所獲得的長度不同的多態(tài)性DNA

7、片段。第15頁，共47頁。RAPD原理圖第16頁，共47頁。遵循孟德爾方式遺傳；隨機引物分子已成為商品，數(shù)量幾乎無限；一次反應可檢測1-10位點；以顯性為主，不受環(huán)境影響，無上位性；成本低，DNA用量少，檢測時間短（一般10小時），靈敏度高，重復性差。第17頁，共47頁。第18頁，共47頁。AFLPAmplified Fragment Length Polymorphism-擴增片段長度多態(tài)性是指通過特定引物和DNA多聚酶鏈式反應復制并擴增不同個體基因組DNA模板后，所得擴增片段在長度上的差異。第19頁，共47頁。不同個體的DNA序列存在差異，在復制特定的DNA序列時所需的引物也可能不同，同一

8、引物可誘導某一個體的DNA片段得以復制，而在另一個體中就可能不能誘導。AFLP技術結合了RFLP與RAPD的特點，揭示的遺傳多型性十分豐富，一次反應可檢測數(shù)十條，AFLP為共顯性標記，成為目前較為經濟，有效，快速的一種分子標記技術。第20頁，共47頁。AFLP分析步驟:選用識別4堿基酶切位點的內切酶MseI和識別6堿基酶切位點的EcoRI（按概率計算，前者識別的酶切位點較后者多）共酶解總DNA；加入人工合成的并能與MseI，EcoRI兩端點連接的接頭分子，再加入分別與兩端特異靶序列（包括兩端接頭序列，酶切位點序列以及在3端延伸的3個隨機堿基）互補的引物分子進行PCR擴增。由于不同試材酶切位點序

9、列及其毗鄰序列的突變，就會在PCR擴增中表現(xiàn)出M-E片段長度的多型性，即稱為擴增片段長度的多態(tài)性（AFLP）。 第21頁，共47頁。第22頁，共47頁。特點用于AFLP分析的限制性內切酶與選擇性堿基組合的數(shù)目和種類很多,AFLP可以產生的標記數(shù)目是無限的；AFLP的多態(tài)性高，一次PCR反應可以同時檢測多個遺傳位點；共顯性；模板用量少，對模板濃度的變化不敏感；擴增的片段較短，分辨率高；利用特定引物擴增，退火溫度高，假陽性低，可靠性高；擴增片段與基因組的單一位置相對應，可作為遺傳圖譜和物理圖譜的位標；分析成本高第23頁，共47頁。 VNTRvariable number tandem repeat

10、-可變數(shù)目串狀重復.在真核生物基因組中，存在許多串狀重復序列，例如CACACA. 或GTGTGT.。由于重復單位的重復次數(shù)在個體間有很大差異，因而可作為一種標記，而不同的重復次數(shù)就構成了不同的等位基因。按重復單位的大小，可分為微衛(wèi)星標記和小衛(wèi)星標記。第24頁，共47頁。VNTR （串聯(lián)重復的數(shù)目變異）探針P1P3P2P45 repeats6 repeats7 repeats8 repeats第25頁，共47頁。SSR （簡單序列的重復） ( Simple Sequence Repeats )隨著基因組測序的發(fā)展 密度增加，定位準確 檢測快速，重復性好 SSR標記將成為基因定位和MAS 的重要技

11、術之一第26頁，共47頁。原理1974年，Skinner等在寄居蟹的基因組中發(fā)現(xiàn)了含TAGG重復單位的簡單重復序列。隨后在人、動物和酵母的基因組中發(fā)現(xiàn)了的大量的簡單重復序列，因其重復單位比小衛(wèi)星短，故稱為微衛(wèi)星（microsatellite）。一般認為微衛(wèi)星是由16bp堿基為核心序列組成一個重復單位，頭尾相連的串聯(lián)序列。微衛(wèi)星序列存在于真核生物的基因組中，呈多拷貝均勻分布。微衛(wèi)星由于其本身核心序列的重復次數(shù)不同而表現(xiàn)出多態(tài)性;微衛(wèi)星位點兩端的側翼序列多是較保守的單拷貝序列，側翼序列使某一微衛(wèi)星特異地定位于染色體的某一部位。第27頁，共47頁。其特點:共顯性的遺傳標記； 豐富的多態(tài)性。可以根據側

12、翼序列設計一對特異的引物，擴增出每個位點的序列，再經聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴增產物的大小，即可檢測出不同個體在每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性。20Nt特異引物第28頁，共47頁。STSSequence-tagged Sites序列標簽位點基因組中長度為200500bp，且核苷酸順序已知的單拷貝序列用PCR技術將其專一擴增出來。STS引物獲得主要來自RFLP單拷貝的探針序列，微衛(wèi)星序列，Alu因子，表達基因序列及人造酵母染色體或粘粒的插入末端序列。第29頁，共47頁。SNP（單核苷酸多型性）single nucleotide polymorphism 是指在單個核苷酸上的突變所引起的多態(tài)。SNP標記技

13、術是九十年代末發(fā)展起來的第三代分子標記。采用SNP技術可將不同試材等位DNA分子區(qū)段間的任一點突變序列檢測出來。由于這一技術要求的儀器設備昂貴，合成的探針數(shù)量大，成本高，目前難以廣泛應用。第30頁，共47頁。基本原理是根據已知的某一DNA分子的核苷酸序列序列，以矩陣（array）方式在芯片(chips)上，依次點入合成的15（或20或25）個堿基的探針（每次移動一個堿基），并對每一探針在第7（或11或13）堿基分別替換成A, T, C, G，合成4個探針為一組，與被熒光標記的總DNA進行分子雜交。在被替換的堿基位點上，可被互補雜交的chip位點會顯示出明顯的熒光（圖 ）。第31頁，共47頁。

14、單核苷酸多型性 SNP (single nucleotide polymorphism)總DNA（DNA片段）序列測定例： 人線粒體DNA片段 16569 bp探針合成 p15.7 p20.11 p25.13 p15.7 ATCCTGATCGGGTAG ATCCTGTTCGGGTAG ATCCTGCTCGGGTAG ATCCTGGTCGGGTAG 第32頁，共47頁。DNA 5 TGAACTGTATCCGACAT .3Primer(p15.7)3 t g a c a t A gg c t g t a g t g a c a t C gg c t g t a g t g a c a t G gg

15、 c t g t a g t g a c a t T gg c t g t a gT G A A C T G T A T C C G A C A TACGT該樣本DNA序列； A C T T G A C A T A G G C T G T AT G A A C T G T A T C C G A C A TACGT該樣本DNA序列； A C T T G A C A T G G G C T G T A第33頁，共47頁。Pyro-sequencing第34頁，共47頁。PCR-SSCPPCRSSCP是基于PCR的單鏈構象多態(tài)性(single-stranded comformation polym

16、orphism)分析技術。基本原理：經PCR擴增的DNA片段在變性劑（如甲酰胺）或低離子濃度下，經高溫處理使之解鏈并保持在單鏈狀態(tài)下，然后于一定濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，當DNA發(fā)生堿基置換突變（點突變）時，會造成單鏈構象不同，通過顯色或顯影在凝膠上顯示出帶型的差別，即多態(tài)性。與PCRRFLP相比，PCRSSCP可以檢測所有的點突變，包括PCRRFLP能夠檢測的酶切位點的突變。第35頁，共47頁。SSCP原理圖解第36頁，共47頁。影響SSCP顯示的因素PCR擴增的特異性要強。設計引物時要使引物能與DNA模板特異性結合，而且引物之間不能形成二聚體，引物內最好不要存在發(fā)夾結構，還要選擇一

17、個合適的退火溫度。PCR擴增的產量要高。PCR擴增的片段不宜過長。一般以100300bp為宜，此時SSCP檢出率約為99；但當DNA片段為300450bp時，其檢出率約為89。第37頁，共47頁。2012.555電泳最能清楚的表現(xiàn)出差異第38頁，共47頁。SSCP結果分析只有一處點突變的情況下，正常個體和突變純合個體在雙鏈DNA完全變性時，應該只有兩條電泳條帶，突變雜合子有4條帶；但大多由于變性不完全，因此在這些帶的前方還有一條帶是沒有變性的雙鏈DNA。雜合子有時只有3條帶，第4條帶在凝膠上常與第3條帶聚在一起難以區(qū)分。實驗過程中特別注意設置對照：包括上樣緩沖液中不加變性劑，未經變性處理的PC

18、R產物作為對照，和已知具有點突變的片段長度相似的DNA作為對照。第39頁，共47頁。 野生型 雜合型 突變型PCR擴增,得到更多特異DNA片段變性中性聚丙烯酰胺凝膠電泳第40頁，共47頁。應用遺傳圖譜的構建數(shù)量性狀位點定位分子標記輔助選擇：通過與目標基因緊密連鎖的分子標記判斷目標基因的存在。遺傳多樣性評估系譜確證第41頁，共47頁。豬氟烷基因的早期選擇氟烷麻醉劑氟烷敏感反應陽性豬在應激的條件下會導致惡性高熱綜合征（MHS）。應激時豬體溫驟然升高至4245，呼吸急促，心跳過速，肌肉僵直，后肢強直，肌體內水及電解質代謝紊亂，肌肉中乳酸大量聚積，嚴重時可引起代謝酸中毒或心力衰竭而驟然死亡。第42頁，共47頁。惡性高熱綜合征與蘭尼定受體基因(ryr1)有關。由蘭尼定受體基因突變造成的。蘭尼定受體是骨骼肌細胞內肌漿網上控制鈣離子（ Ca2+ ）進出肌纖維的通道，應激敏