iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)課件

1、iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)廣州輝駿生物科技有限公司第1頁，共21頁。主要內(nèi)容iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介iTRAQ試劑標(biāo)記原理iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢(shì)iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例iTRAQ實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟輝駿生物第2頁，共21頁。iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介 iTRAQ技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年開發(fā)的同重標(biāo)簽標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)。 iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）連接的胺標(biāo)記同重

2、元素。在一級(jí)質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。 在一級(jí)質(zhì)譜中，不同來源的相同肽段表現(xiàn)為一個(gè)峰； 在二級(jí)質(zhì)譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異；同時(shí)，肽段的MS/MS結(jié)果結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索可以鑒定出相應(yīng)的蛋白種類（圖1）。輝駿生物第3頁，共21頁。圖1 iTRAQ技術(shù)原理圖輝駿生物第4頁，共21頁。iTRAQ試劑標(biāo)記原理iTRAQ試劑包括3部分：報(bào)告部分肽反應(yīng)部分平衡部位(圖2) 報(bào)告部分共有8種：質(zhì)量數(shù)分別為114121Da，因此iTR

3、AQ最多可同時(shí)標(biāo)記8組樣品（客戶可按需選擇標(biāo)記個(gè)數(shù)）。 肽反應(yīng)部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接，從而將報(bào)告部分和平衡部位標(biāo)記到肽段上，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)。 平衡部分：質(zhì)量數(shù)分別為3124Da，與報(bào)告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本的同一肽段具有相同的質(zhì)荷比。圖2 ITRAQ試劑結(jié)構(gòu)輝駿生物第5頁，共21頁。iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢(shì)靈敏度高：可檢測(cè)出低豐度蛋白；分離能力強(qiáng):可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等；適用范圍廣：可以對(duì)任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，特別適用于采用多種處理

4、方式或來自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析；結(jié)果可靠：定性與定量同步進(jìn)行，同時(shí)給出每一個(gè)組分的相對(duì)表達(dá)水平、分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；自動(dòng)化程度高：液質(zhì)連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。輝駿生物第6頁，共21頁。iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程。 1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質(zhì)； 2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切； 3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標(biāo)記； 4：等量混合各樣本中的標(biāo)記肽段； 5：MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及分析。 輝駿生物第7頁，共21頁。iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例1: 提取各組蛋白質(zhì)、定量并用胰酶酶切；2. 各組肽段分別用4種iTRAQ試劑標(biāo)記

5、(例如對(duì)照組用iTRAQ 117標(biāo)記，其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別用iTRAQ 114, 115, 116標(biāo)記)；3. 標(biāo)記好的各組樣本等量混合，液相分離和質(zhì)譜分析. 4: 不同樣本中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)可通過二級(jí)質(zhì)譜中iTRAQ試劑的峰面積確定，如圖所示：與對(duì)照組相比，該蛋白在3個(gè)處理組(114-116)中的相對(duì)表達(dá)量較高。5. 根據(jù)該肽段的二級(jí)質(zhì)譜峰圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，得到蛋白的定性信息。輝駿生物第8頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟ABI試劑盒輝駿生物第9頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟1：蛋白質(zhì)提取 可以選擇提取蛋白質(zhì)常用的各種溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因?yàn)檫@些試劑會(huì)干擾iTRAQ試

6、劑的標(biāo)記反應(yīng)。輝駿生物第10頁，共21頁。輝駿生物第11頁，共21頁。輝駿生物第12頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟2：蛋白質(zhì)定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各組樣本的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-APGE電泳，銀染定量，根據(jù)每個(gè)涌道染色情況微調(diào)蛋白濃度，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中每組樣本的蛋白量相同。輝駿生物第13頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟3：酶切，標(biāo)記每組樣本（各100g）分別加入-20預(yù)冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20沉淀30min4h（根據(jù)樣品所需沉淀量選擇時(shí)間，一般開始時(shí)可選1小時(shí)）；12000rpm 離心15分鐘，棄上清，用試

7、劑盒中自帶的溶解液dissolution buffer（20L） 和1% SDS(1L)充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2L，混勻，60 反應(yīng)1h；加入半胱氨酸封閉試劑（cystine blocking regent）1L,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質(zhì)=1：20的比例加入trypsin酶,37酶解過夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管標(biāo)記試劑中加入50L異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)1h，之后各加入3倍體積的水，使標(biāo)記試劑分解。標(biāo)記和樣品對(duì)應(yīng)關(guān)系如下:4R117,未知118，BOO6119,11R121；合并各管標(biāo)記好的

8、樣品，真空冷凍干燥。輝駿生物第14頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟4： 除鹽，此步操作是將標(biāo)記過程中的標(biāo)記試劑和相關(guān)buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。 （1）100%乙腈沖洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次 （3）用400uL 0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上 （4）0.1%TFA 沖洗柱子35次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA 400L洗脫下樣品 （6）將樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分析。輝駿生物第15頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟5: 第一維強(qiáng)陽離子柱(SCX)分離（1）儀器及試劑： 色譜儀20AD(島津) 真空離心濃縮機(jī)(Christ RVC 2-25

9、，Christ，Germany) 磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)) 氯化鉀(國(guó)藥集團(tuán)) 乙腈ACN(Fisher)（2）具體操作參數(shù) 柱子信息：Polysulfoethyl column,2.1mm*100mm,5u,200A, The Nest Group,Inc.MA A相：10mM KH2PO4，25% CAN，PH 2.6 B相：10mM KH2PO4，350mM KCl，25%ACN，PH 2.6 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm/280nm 流速：200L/min 梯度：60min輝駿生物第16頁，共21頁。 B%從5分鐘5%到40分鐘上升至25% Time(min) B% 0 0 5 5 40 2

10、5 45 80 50 80 51 0 60 stop 根據(jù)峰型和時(shí)間共收取20個(gè)梯度,真空離心濃縮后，用50L RPLC A相5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)溶解，進(jìn)行第二維分析。輝駿生物第17頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟6: 第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS（1）儀器及試劑 色譜儀20AD(島津) 質(zhì)譜儀 QSTAR XL（Applied Biosystem,USA） 乙腈ACN(Fisher) 甲酸（TEDIA）（2）具體操作參數(shù) 反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 m, 300A, 0.1 x 150mm ，microm ,USA) 色譜分離90min，梯度B%從5分鐘5%到70分鐘上升至35%。 A相：5%ACN,0.1%甲酸 B相：95%ACN,0.1%甲酸 流速： 300nL/min輝駿生物第18頁，共21頁。 Time(min) B% 5 5% 90 35% 95 80% 100 80% 105 5% 120 stop質(zhì)譜鑒定：MS掃描范圍400-1800 MS/MS掃描范圍100-2000 IDA 采集模式 一個(gè)圖譜選擇四個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描。輝駿生物第19頁，共21頁。iTRAQ詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟7: 數(shù)據(jù)檢索(1)蛋白質(zhì)檢索 檢索軟件：Protein Pilot