瓜氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)

1、湖北大學發(fā)酵工程與設備課程設計題目：瓜氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)專業(yè)年級：11級生物工程學生姓名：學 號：指導老師：2014年5月 24日目 錄1前言1.1瓜氨酸性質(zhì)瓜氨酸(citrulline),又名氨基甲酰鳥氨酸(carbamyl ornithine) , L- 瓜氨酸分子式為C6H13N3O3，分子量175.19，純品為白色結(jié)品或結(jié)品粉末，有酸味 微溶于水，不溶于乙醇和乙醚。瓜氨酸的熔點為222C，等電點為5. 92,比旋 光度為a D25 = 21. 0。瓜氨酸最先由右賀太郎等在1914年從西瓜榨汁中分離 得到，此后由和田光德確認為一種氨基酸。1除了西瓜汁中含有瓜氨酸之外，野 西瓜葉、核桃仁、核桃

2、幼苗及種子中都含有瓜氨酸。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)a - 氨基酸，它具有肽鍵形成的能力，但是很少參與蛋白質(zhì)的合成，僅存在于人類的 少數(shù)幾種蛋白中，包括絲集蛋白、中間絲集蛋白、人腦髓鞘堿性蛋白(MBP)、 聚角蛋白微絲蛋白及一些組蛋白。瓜氨酸結(jié)構(gòu)式：% T ，尹N C CH CH2 OHch2NH1.2瓜氨酸的應用瓜氨酸在人體內(nèi)代謝途徑:,“KCifrX,.g.MAg圖14 JU就醛的生物代謝途徑防治前列腺疾病瓜氨酸對防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺腫脹、前列腺肥大、前列腺增生癥、前列腺癌作用明顯。治療L-精氨酸缺乏引起的相關疾病和提高男性性功能 研究表明， 瓜氨酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為人體必需氨基酸L-

3、精氨酸和一氧化氮，產(chǎn)生的L-精氨酸可 以彌補食物中L-精氨酸的缺乏；一氧化氮會活化酵素，導致平滑肌舒張，使人 的血管獲得松弛，在維持心血管正常功能也發(fā)揮著重要作用4，同時也可以用 于增強男性性功能，以及治療性功能障礙?？顾ダ虾驮鰪娒庖吡?研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸有較強的抗氧化能力，能 夠清除羥基，增加精氨酸合成所需的NO,可有效保護DNA及PMN免受氧化反應 的侵害，可以作為抗衰老、提高免疫力的保健品，也可作為女性美容化妝品， 具有護膚防皺祛斑抗衰老之功效。提高運動員肌肉力量與耐力精氨酸對于人體的運動機能有良好的促進作用，L-瓜氨酸作為合成L-精氨酸的前體，在許多組織中能轉(zhuǎn)化成L-精 氨酸，服用瓜氨酸能

4、有效的改善人體的抗疲勞能力，維護健康的心肺功能，提 高腦力清晰度，降低壓力和克服沮喪情緒，平衡血糖濃度，增強人體的肌肉強 度，提高體能，在運動保健方面具有良好的作用。其它作用除了以上應用，瓜氨酸還可以用作異體排斥效應指示劑,診斷類風濕關節(jié)炎6 等。與瓜氨酸相關的疾病 與瓜氨酸相關的疾病有類風濕關節(jié)炎，瓜氨 酸是RA（RA是一種以關節(jié)滑膜炎為特征，以多發(fā)性關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，進 而導致關節(jié)畸形、功能障礙的常見致殘性疾?。┗颊哐逯锌菇z集蛋白相關抗體 識別的主要抗原決定簇成分。瓜氨酸血癥，瓜氨酸血癥是因為尿素循環(huán)中的精 氨酸琥珀酸合成酶(ASS)缺陷所致,患者血、尿及腦脊液中瓜氨酸均升高，由于尿

5、 素循環(huán)受阻引起高氨血癥。1.3瓜氨酸的國內(nèi)外生產(chǎn)及研究現(xiàn)狀瓜氨酸生產(chǎn)方法化學法 化學法是被最早應用的生產(chǎn)瓜氨酸的方法，目前為止 也是生產(chǎn)瓜氨酸最主要的方法?；瘜W法生產(chǎn)瓜氨酸是指在堿性條件下水解L-精 氨酸得L-瓜氨酸，過程控制比較困難，產(chǎn)品中含有旋光對映體DL-瓜氨酸，影響 產(chǎn)品質(zhì)量，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水，污染環(huán)境，化學法生產(chǎn)也因此受到限制。 國內(nèi)還報道過以L-鳥氨酸鹽酸鹽為原料與堿式碳酸銅反應生成二鳥氨酸合銅保 護a -NH2,用尿素對a -NH2進行甲?；?，得到二瓜氨酸合銅，后用H2S除銅離 子得到L-瓜氨酸。提取法由于天然產(chǎn)物中瓜氨酸含量極其有限，因此提取法受到原料來源限制，生產(chǎn)規(guī)模

6、小，工藝較復雜，分離提取困難，產(chǎn)酸率低，成本高， 經(jīng)濟效益差等缺點都嚴重限制了提取法在工業(yè)生產(chǎn)上的應用。但相對于傳統(tǒng)方法， 提取法能得到天然瓜氨酸，因此找到一種廣泛生長的富含瓜氨酸的植物也是一種 很好的研究方向。發(fā)酵法 發(fā)酵法是生產(chǎn)天然瓜氨酸的一種比較普遍的方法。歐 美對于這方面的研究報道比較多，方法也較成熟。尤其是日本對這方面的研究比 較深入。Okumura 等用 Bacillus subtilis K-X-1 A-9(ATCC 15562)發(fā)酵生產(chǎn) 瓜氨酸；日本Kyowa Hakko Kogyo公司網(wǎng)培養(yǎng)能夠利用烴類作為碳源的石蠟節(jié) 桿菌Arthrobacter paraffineus精氨

7、酸需求型的突變株發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸。酶法 酶法生產(chǎn)瓜氨酸采用Streptococcus faecalis， Clostridium perfringens，Micrococcus pyogenes，Bacillus pyocyaneus， Baker s yeastu廣13微生物生產(chǎn)的精氨酸分解酶，精氨酸脫亞氨基酶，由精氨酸 生產(chǎn)瓜氨酸。酶法合成瓜氨酸，大多采用一步酶促反應，因而可避免瓜氨酸全合 成途徑中復雜的反饋調(diào)節(jié)作用，使瓜氨酸可以積累到較高的濃度。Chibata等14 報道 Pseudomonas putida ATCC4359， Pseudomonas fluorescen IFO 308

8、1， Pseudomonas ovalis IAM 1002，Leuconostoc citrovorum ATCC 8081 等可以生 產(chǎn)精氨酸脫亞氨基酶，以L-精氨酸或DL-精氨酸為底物，得到較高濃度瓜氨酸。 曹瑜等15利用糞鏈球菌精氨酸脫亞胺酶轉(zhuǎn)化L-精氨酸制備L-瓜氨酸。進而有報 道采用固定化糞鏈球菌酶法連續(xù)生產(chǎn)L-瓜氨酸16，該法可連續(xù)化生產(chǎn)，大大提 高生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。化學-生物法劉毅等17用化學-生物法制備D-精氨酸和L-瓜氨酸，通過添加催化劑，快速消旋為DL-精氨酸。后以DL-精氨酸為底物，利用酶法同時制備D-精氨酸和L-瓜氨酸D-精氨酸參與組成的多肽，可抑制癌癥擴散，

9、 治療生長激素釋放過多造成的紊亂，還具有抑制DNA合成、前列腺癌細胞增殖 等功能。表L L-感毓晚生產(chǎn)方式比救西瓜提取法化學法酶法發(fā)醇法主要原料西m精匏酸精覽酸院萄轆產(chǎn)酸率W0.529100%m4%以上回攻率S況83.58080成本(町元/噸)18, 9以上15以上15以上1。以內(nèi)主箜存在問題受季節(jié)，產(chǎn)量、地含有旋輪好映體尸瓜筑酸.穿響原料成本高，度精產(chǎn)酸率較低域等因素再皚產(chǎn)品質(zhì)量生產(chǎn)速程中產(chǎn)生大量酸成本限制廢水，污染壞舅綜上所述，采用發(fā)酵法生產(chǎn)爪氨酸是最有潛力的爪氨酸生產(chǎn)方式，但國內(nèi)原 來存在看菌.種產(chǎn)陵率虬 不穩(wěn)定等缺點所以未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，采用割思路 新手段對瓜饕酸發(fā)酵進行改造優(yōu)化，可

10、以實現(xiàn)芟大規(guī)模生產(chǎn)。2發(fā)酵工藝瓜氨酸發(fā)酵可以采用Bacillus subtilis K-X-1 A-9(ATCC 15562)、糞鏈球 菌(Streptococcus faecal)或者能夠利用烴類作為碳源的石蠟節(jié)桿菌 Arthrobacter paraffineus精氨酸需求型的突變株，傳統(tǒng)上采用研究透徹的生 長條件易控制的枯草芽孢桿菌19或黃色短桿菌進行L-瓜氨酸發(fā)酵。本課程設計題目以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種進行探究瓜氨酸的發(fā)酵工藝。瓜氨酸發(fā)酵采用通用的微生物液體發(fā)酵技術(shù)，工藝流程及發(fā)酵設備也基本相 同。2.1發(fā)酵工藝流程空氣凈化處理發(fā)酵的施程主發(fā)酵產(chǎn)物分離豌化 I成品或源、緘漁、 無機鹽等

11、營拆 物質(zhì)I 擴大培養(yǎng)保藏菌種斜血活化2.2發(fā)酵設備酵2.3瓜氨酸的分離提純分離流程發(fā)爵鯉一魅建龔涉鼻留耕臨麟埴箜一戢成沮折堇引術(shù)野孩交予層寅親惜吸電E生勰術(shù)下禎三晚的麒略除朋魅瓣瓜氨酸的分離純化，工業(yè)上？3發(fā)酵機制及原理瓜氨酸發(fā)酵是根據(jù)瓜氨酸在微生物細胞內(nèi)的代謝途徑來確定的，在微生物 細胞內(nèi)有兩條代謝途徑，兩條途徑的主要區(qū)別在于某些參加反應步驟的酶不同以 及在個步驟的反饋或阻遏不同，大體上都是從谷氨酸(Glu )反應生成鳥氨酸(Orn) 再反應產(chǎn)生瓜氨酸(Cit)、精氨酸(Arg)。因此要得到瓜氨酸就需要在瓜氨酸反應 生成精氨酸過程中截斷，所以可以采用Arg-或營養(yǎng)缺陷性類似物抗性多重突變株

12、 發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸。用EE”制財響vm 反 giaWl-4成虱酸很4物代謝途楠i1： N乙酰谷氛酸合成爵2； N乙酰答氮酸激牌；3, N-乙酰谷敘酸-Y 半藤基 脫氫酩4： N乙袱鳥氮酸 8以基料移帆5： N-乙酸鳥氨酸虹6：島瓠成氨 基俄基牡修牌；7：精知酸琥弟合成線；：精？XIR琥珀酸倒3b N-心酰芥薰兼合成加條M N酰答氨愀瀚懈士 N乙眺谷氯隔T#整 基脫氫隔：L N乙酸俗氟或干氛婚移曲負N乙酰谷泌腿乙酰身裁展乙 戡基轉(zhuǎn)移醇協(xié)冉疑酸敏甲基轉(zhuǎn)卻酵：7=珀城琥始合成麗：&捕藐琥幼酸酣4菌種的制備及種子的擴大培養(yǎng)4.1擴大培養(yǎng)的基本流程：保藏菌種一斜面活化一一級種子搖瓶培養(yǎng)一二級種子罐培養(yǎng)一發(fā)

13、酵罐4.2實驗室種子及種子罐種子的制備菌種制備也稱種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴大培養(yǎng)成為具有一 定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進一步擴大菌體量及 合成產(chǎn)物之用。菌種制備過程就是選用保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種，接種到瓊脂斜 面培養(yǎng)基上，在25C（不同菌種溫度不同）下培養(yǎng)57天（或較長時間）。所得 孢子還需進一步用較大表面積的固體培養(yǎng)基以獲得更多孢子。將培養(yǎng)成熟的斜面 孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于2528C培養(yǎng)14天。將成熟的 扁瓶孢子于真空中抽十，使水分降至10%以下，并放入4C冰箱中備用。一次制 得的孢子瓶可在生產(chǎn)上延續(xù)使用半年左右。所獲得的

14、大量孢子可直接作為種子罐 的種子，接種量一般在10%20%。5培養(yǎng)基5.1培養(yǎng)基的組成及制備枯草桿菌：葡萄糖11-13%，亞適量精氨酸0.5g/L，NHCl作氮源，磷鹽（KH PO424和 K2HPO4），黃色短桿菌（精氨酸缺陷型突變株賦予磺胺胍抗性）：在11%葡萄糖發(fā)酵液 培養(yǎng)基中，可生成瓜氨酸30g/L，而在含有3%葡萄糖、0.5%乙酸銨的初始培養(yǎng)基 中，流加乙酸和乙酸胺混合液進行培養(yǎng)，則可最終生產(chǎn)瓜氨酸47g/L。5.2培養(yǎng)基的滅菌按培養(yǎng)基組成配置培養(yǎng)基后，為防止雜菌的污染，需采用濕熱滅菌法對培養(yǎng) 基進行滅菌，即利用飽和蒸汽滅菌。在高溫條件下，微生物細胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)， 如酶等，會發(fā)生不

15、可逆變性，導致微生物死亡。培養(yǎng)基的濕熱滅菌方式有兩種： 間歇滅菌（分批滅菌、實消）、連續(xù)滅菌（連消）。間歇滅菌間歇滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基同時放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將 培養(yǎng)基和所用設備一起進行加熱滅菌，通常也稱為實罐滅菌。開始滅菌時，應先 放去夾套或蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，通過空氣管向發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基通入 蒸汽進行加熱，同時，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進行間接加熱。當培養(yǎng)基溫度升到 70C左右時，從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽進一步加熱，當溫度升至120C， 罐壓為一個大氣壓時，打開接種、不料、消泡劑、酸堿等管道閥門進行排氣，當 然，在保溫過程中，應注意凡在培養(yǎng)基液面下的各種進口管道都應

16、通入蒸汽，而 在液面以上的其余各管道則應排放蒸汽，這樣才能不留死角，從而保證滅菌徹底。 保溫結(jié)束后，依次關閉個排汽、進汽閥門，待罐內(nèi)壓力降下來后，向罐內(nèi)通入無 菌蒸汽，在夾套或蛇管中通冷水降溫，是培養(yǎng)基的溫度降到所需的溫度，進行下 一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。這種滅菌方法不需要專門的滅菌設備，投資少，對設備、蒸 汽的要求也比較低，且滅菌效果可靠，所以是中小型發(fā)酵工廠常用的培養(yǎng)基滅菌方法。滅菌設備及方式:消株補酸濟料戚發(fā)赫罐的管路布置兩個撮及連接管的蒸汽殺留連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時進行加 熱、保溫和冷卻而進行滅菌。連續(xù)滅菌的基本設備包括配料預熱罐、連消塔、維 持罐

17、、冷卻管。在滅菌過程中可以使用蒸汽噴射器，使培養(yǎng)基與高溫蒸汽(140C) 直接接觸，從而在短時間內(nèi)可將培養(yǎng)基急速升溫至預定的滅菌溫度(126-132C), 然后短時間維持該溫度滅菌，滅菌后的培養(yǎng)基通過一膨脹閥進入真空冷卻器急速 冷卻；也可以采用薄板換熱器作為培養(yǎng)基的加熱和冷卻器，蒸汽在薄板換熱器段 使培養(yǎng)基升溫，經(jīng)維持段保溫一段時間后，培養(yǎng)基在薄板換熱器的冷卻段進行冷滅菌設備及方式：蒸汽 lTL冷卻水卻，從而可以使培養(yǎng)基的預熱、加熱滅菌及冷卻過程在同一設備內(nèi)完成。與間歇 滅菌相比，連續(xù)滅菌最突出的優(yōu)點是易于實現(xiàn)管道化和自控操作以及大規(guī)模生產(chǎn)， 因此連續(xù)滅菌越來越多的被用于培養(yǎng)基的滅菌。配料罐

18、泵 加熱塔 維持罐冷卻管滅菌介質(zhì)保溫段噴射加熱連續(xù)滅菌流程原料介質(zhì) 蒸汽T-140度L 3障板換熱器連續(xù)滅菌流程韭持罐120 r出料35 UC1200蒸汽】47P進料 35 E 100 P120 UC發(fā)酵堵6無菌空氣6.1無菌空氣處理流程瓜氨酸發(fā)酵采用枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，在發(fā)酵過程中需要無菌空氣。 空氣凈化處理的目的是除菌，目前所采用的過濾介質(zhì)必須在干燥條件下工作，因 此空氣需要預處理以除去空氣中的油、水和較大的顆粒，才能保證除菌效率。除菌的方法很多，如過濾除菌、熱殺菌、靜電除菌、輻射殺菌等，各種方 法的除菌效果、設備條件、經(jīng)濟指標各不相同。一般發(fā)酵工廠采用經(jīng)濟實用的過 濾除菌法，通過定

19、期滅菌的介質(zhì)來過濾流過空氣所含的微生物，而取得無菌空氣 的。常用的過濾介質(zhì)有棉花、活性炭或玻璃纖維、有機合成纖維、有機、無機和 金屬燒結(jié)材料等。無菌空氣的制備大致包括以下過程：空氣一高空取氣管一除塵器一空氣壓 縮機一貯氣罐一一級冷卻器一油水分離器一二級冷卻器一除霧氣一加熱器一總 過濾器一分過濾器一無菌空氣。現(xiàn)在也有一些新型設備出現(xiàn)，比如以電腦式空氣濾潔器代替高空采風塔， 以組合式空氣除濕加熱裝置，代替分體式除油除水加熱設備20 6.2無菌空氣制備系統(tǒng)后空/罔思？到川空氣壓耶凱產(chǎn)生的熱迎有大檔】一-礎iifli 槌日就跖SKiUJ-t一虹勺螂5-腮愚瑞8死卷航秒?yún)s襯； T 凋稼摳曹機】占一所她器

20、：，一削近譴雅椅一空弋嘛K塔空氣0S L5-19 次冷鄭和析水的空氣曲處理源程1博室桀R 3粗過雄th 3空壓機，4一詹蛔5- S析水喘I7忙氣場|息一加熱凱9一恩土泌器I 1。一分過涎器國1.5-2。二次吟卻和析水的空氣血姓理流程I一高空編鳳I ?粗過攜疆；3-空壓機L 一冷卻器5t 7折水髭I 8 1，堵19一抑焦器t 10空，總過展器* I】。空氣分過漁器7發(fā)酵廢物處理氨基酸發(fā)酵產(chǎn)生的廢物主要有廢水和尾氣。7.1尾氣處理發(fā)酵過程中排出的尾氣中含有一些生產(chǎn)菌、雜菌以及噬菌體等，容易對環(huán)境 造成污染。國內(nèi)外一些發(fā)酵企業(yè)對此的做法是把發(fā)酵罐、種子罐的尾氣收集到一 只或數(shù)只裝有殺菌藥劑的回收罐中

21、，用泵進行循環(huán)吸收消毒滅菌，用蒸汽消毒殘 液，并不定期更換藥劑。207.2廢水處理氨基酸生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生母液和洗水兩組廢水，兩種廢水都含有濃度較高的 鹽分和COD值。鹽分主要為硫酸銨或氯化銨，COD則主要來自生產(chǎn)過程中氨基酸 產(chǎn)品和副反應等的殘余物。處理技術(shù)的選擇主要取決于廢水的成分組成、要求達 到的處理效果及經(jīng)濟性。根據(jù)國內(nèi)外工程實例及資料介紹，目前處理氨氮廢水的實用方法主要有生物處理法、蒸餾法、折點加氯法、離子交換法及吹脫法、膜濃 縮法21以及活性污泥法。對于高濃度廢水可以采用以下方法處理：提取菌體蛋 白后噴漿造粒生產(chǎn)復混肥；生產(chǎn)飼料酵母；生產(chǎn)家禽飼料添加劑。對于低濃度廢 水目前主要采用厭

22、氧生物法處理。生產(chǎn)沈水康由CafOUlo PAW|牛產(chǎn)程鍬撤水 I旅求盼知也M灘沉煌藏1一 q a = . |；頊W1偵學姓舞弟象：|出水觀晚起圍1溶水處理工藝流程固8參考文獻劉娟，路欣欣，孟慧.瓜氨酸的藥理作用及生產(chǎn)方法的研究進展J.藥學 實踐雜志，2011，29（3）： 173-216.王玉俊，趙虎.抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測的應用進展J.上海醫(yī)學，2009, 32 （10）:931-934.Maritza J.R, Daniel H.P, Ruth B.C, et al. The rapeutic use of citrulline in cardiovascular disease J .

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