半抗原和蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)

1、關(guān)于半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)第一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原與半抗原第二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗原 能與淋巴細(xì)胞抗原受體（TCR/BCR）特異性結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（指抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)、外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。第三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原的分類(lèi)天然抗原 如：細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等。人工抗原 如：人工結(jié)合抗原、人工合成抗原、 基因工程抗原第四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的天然抗原-細(xì)菌鏈球菌痢疾桿菌霍亂弧菌傷寒桿菌第五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的

2、天然抗原-病毒狂犬病病毒腺病毒口蹄疫病毒流感病毒第六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的其他天然抗原真菌白色念珠菌 (1,000X oil) 瘧原蟲(chóng)第七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的其他天然抗原 異種動(dòng)物血清 異嗜性抗原 血型抗原 主要組織相容性抗原 腫瘤抗原超抗原第八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原 人工結(jié)合抗原 將無(wú)免疫原性的簡(jiǎn)單化學(xué)基團(tuán)與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，或?qū)o(wú)免疫原性的有機(jī)分子與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，形成載體-半抗原結(jié)合物，均屬人工結(jié)合抗原。 第九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原 人工合成抗原 用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成

3、為合成多肽。（應(yīng)用這種人工合成多肽可研究氨基酸種類(lèi)、序列與蛋白質(zhì)抗原性及免疫原性的關(guān)系。） 第十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原基因工程抗原通過(guò)基因重組、再表達(dá)制備的抗原物質(zhì)。如：目的基因（編碼抗原）+ 載體（質(zhì)粒等） 重組DNA 細(xì)胞（真核或原核） 表達(dá) 純化 基因工程疫苗第十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原的性質(zhì)1.免疫原性： 抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，誘生相應(yīng)抗體和效應(yīng)淋巴細(xì)胞的能力。2.抗原性: 抗原可在體內(nèi)、外與相應(yīng)的抗體/效應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。第十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月抗原（按照免疫原性及免疫反

4、應(yīng)性）分類(lèi)1、完全抗原 : 既有免疫原性又有抗原性的物質(zhì)，如多數(shù)蛋白質(zhì)分子。2、半抗原:又稱不完全抗原，單獨(dú)存在時(shí)只具有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)，如二硝基酚、青霉素。第十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月完全抗原半抗原與載體結(jié)合后可使其具有免疫原性。半抗原+載體 完全抗原第十四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月半抗原 +載體抗體BT完全抗原BBBT第十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白第十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白常用來(lái)作為合成人工抗原的載體蛋白質(zhì)有： 牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OA)、 鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)

5、、 人血清白蛋白(HSA) 人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等。 第十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白牛血清白蛋白（BSA）包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66.43kDa，等電點(diǎn)為4.7。 BSA結(jié)構(gòu)第十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白卵清蛋ovalbvmin 是一種糖蛋白。含有微量的磷。 是卵清中蛋白質(zhì)的主要成分，約占65。 雞的卵清蛋白分子量約45kDa。a.牛血清白蛋白b.磷酸酪氨酸血清白蛋白c.卵清蛋白d.磷酸酪氨酸卵清蛋白第十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)由于KLH質(zhì)量大，復(fù)雜性高，

6、與其他載體蛋白相比KLH會(huì)引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。來(lái)源于軟體動(dòng)物，它在系統(tǒng)發(fā)生上遠(yuǎn)離哺乳動(dòng)物物種，在測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生會(huì)與典型靶點(diǎn)樣品發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性較小。第二十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白 人血清白蛋白（簡(jiǎn)稱HSA），是人血漿中的蛋白質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽包含585個(gè)氨基酸，分子量為66kD。在血漿中其濃度為42g/L，約占血漿總蛋白的60%。第二十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常見(jiàn)的偶聯(lián)蛋白 -多聚賴氨酸是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的微生物類(lèi)食品防腐劑。它是由2530賴氨酸殘基聚合而成，具有強(qiáng)烈的抑菌能力，可以作為防腐劑用于食品的保鮮。

7、第二十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月偶聯(lián)蛋白的性質(zhì) 載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán)，這些基團(tuán)可以直接與抗生素或農(nóng)藥分子偶聯(lián)，這是化學(xué)偶聯(lián)制備抗原的前提； 其次，載體應(yīng)具備一定的容量，可以偶聯(lián)足夠的分子； 載體還應(yīng)該是惰性的，不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能； 而且載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性，且應(yīng)該是廉價(jià)易得的。第二十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原合成方法第二十四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原合成方法 小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)效果會(huì)受到偶聯(lián)物的濃度及其相對(duì)比例、偶聯(lián)劑的有效濃度及其相對(duì)量、緩沖液成分及其純度和離子強(qiáng)度、pH以及半抗原的穩(wěn)定性、可溶性和

8、理化特性等因素的影響。 一般是由半抗原上的活性基團(tuán)決定偶聯(lián)合成的方法。第二十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月半抗原上的活性基團(tuán)第二十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原合成方法1、分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶聯(lián)A、混合酸酐法 。B、碳化二亞胺法。C、N-羥琥珀酰亞胺酯法 第二十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月混合酸酐法交聯(lián)原理第二十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月混合酸酐法交聯(lián)原理第二十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月碳化二亞胺法交聯(lián)原理第三十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月碳化二亞胺法交聯(lián)原理第三十一張，PPT

9、共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月碳化二亞胺法交聯(lián)原理第三十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原合成方法2、含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)1）戊二醛法：雙功能試劑戊二醛的兩個(gè)醛基分別與半抗原和蛋白質(zhì)上的氨基形成schiff鍵(-N=C，在半抗原和蛋白質(zhì)間引入一個(gè)5碳橋。這一反應(yīng)條件溫和，可在440及pH6.08.0內(nèi)進(jìn)行，操作亦簡(jiǎn)便，因此應(yīng)用廣泛。2）重氮化法：用于活性基團(tuán)是芳香胺基的半抗原，芳香胺基與NaNO2和HCl反應(yīng)得到一個(gè)重氮鹽，它可直接接到蛋白質(zhì)酪氨酸羧基的鄰位上，形成一個(gè)偶氮化合物。第三十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月戊二醛法合成人工抗原的原理第三十

10、四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鹽酸克倫特羅重氮化反應(yīng)原理第三十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原合成方法3、含羥基半抗原的偶聯(lián)1）琥珀酸酐法；2）羰基二咪唑法。第三十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原合成方法4、含巰基半抗原的偶聯(lián) 1)馬來(lái)酰亞胺法。 2) 將載體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中，通過(guò)過(guò)氧化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上。第三十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響人工抗原質(zhì)量的因素第三十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響人工抗原質(zhì)量的因素 偶聯(lián)比 過(guò)去人們認(rèn)為，聯(lián)接到蛋白質(zhì)分

11、子上的半抗原數(shù)目要盡可能多。但實(shí)驗(yàn)證明，過(guò)多的半抗原并不能得到預(yù)期的結(jié)果，這是因?yàn)檩d體上覆蓋的半抗原分子過(guò)多時(shí)，可能不利于載體與淋巴細(xì)胞表面結(jié)合，不能使載體引起免疫反應(yīng)。 研究發(fā)現(xiàn)各種載體的分子量不論是否接近，最佳結(jié)合比都不盡相同，并建議為了取得最佳免疫效果，應(yīng)逐個(gè)確定各種載體的最佳結(jié)合比。第三十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響人工抗原質(zhì)量的因素偶聯(lián)橋有研究者認(rèn)為，一定長(zhǎng)度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所產(chǎn)生抗體專(zhuān)一性的增強(qiáng)但也有一些研究者發(fā)現(xiàn)，手臂結(jié)構(gòu)對(duì)免疫檢測(cè)經(jīng)常有不利的影響，有時(shí)產(chǎn)生的抗體對(duì)手臂結(jié)構(gòu)親和力特別強(qiáng)，對(duì)待測(cè)小分子親和力卻很弱，因此造成對(duì)特異性抗體檢

12、測(cè)的干擾。 可以采取兩種方法來(lái)避免因偶聯(lián)橋而造成的不足：一是半抗原上相同位點(diǎn)結(jié)合蛋白質(zhì)，但免疫原和包被抗原用不同的偶聯(lián)橋；二是免疫原和包被抗原用相同的偶聯(lián)橋，但與不同半抗原位點(diǎn)結(jié)合。最好的偶聯(lián)橋是36個(gè)直鏈的碳原子結(jié)構(gòu)。第四十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響人工抗原質(zhì)量的因素半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)用來(lái)作半抗原的分子最好有分支結(jié)構(gòu)，直鏈分子難以產(chǎn)生抗體。此外，有些抗生素或農(nóng)藥有多個(gè)可供蛋白質(zhì)偶聯(lián)的位點(diǎn)，但據(jù)研究報(bào)道，不同位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合制備的人工抗原產(chǎn)生的抗體效價(jià)及親合力都有差別，這可能是因?yàn)椴煌稽c(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致半抗原呈現(xiàn)的空間結(jié)構(gòu)不一樣的原因。因此，如果一個(gè)分子內(nèi)有多個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)

13、，最好盡可能利用不同位點(diǎn)都合成出人工抗原，然后，通過(guò)比較，篩選出最好的人工抗原用于制備抗體作為檢測(cè)。第四十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)第四十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)第四十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)第四十四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原的質(zhì)量評(píng)定第四十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原的質(zhì)量評(píng)定合成成功鑒定鑒定農(nóng)藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法，如果人工抗原的紫外吸收?qǐng)D譜不同于原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，則可初步證明人工抗原合成成功。

14、第四十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月紫外分光光度法測(cè)定人工抗原偶聯(lián)質(zhì)量第四十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原的質(zhì)量評(píng)定濃度測(cè)定人工抗原的絕對(duì)含量常以蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白質(zhì)多少mg）。因此測(cè)定人工抗原的濃度與測(cè)定人工抗原溶液中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量（mg/ml）是一致的。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、雙縮脲法、微量凱式定量法、染色結(jié)合法和熒光法等。第四十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原的質(zhì)量評(píng)定純度鑒定 利用吸附與分配層析和電泳技術(shù)可鑒定人工抗原的偶聯(lián)的純度。如果電泳圖譜上只出現(xiàn)一條電泳帶，則表明人工抗原達(dá)到電泳純，否則說(shuō)明人工抗原中含有未偶聯(lián)的物質(zhì)。第四十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月利用電泳技術(shù)鑒定人工抗原偶聯(lián)的純度第五十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工抗原的質(zhì)量評(píng)定偶聯(lián)比的測(cè)定分光光度法