內(nèi)源性活性物質(zhì)

1、體內(nèi)藥物分析內(nèi)源性活性物質(zhì)的分析1內(nèi)源性活性物質(zhì)1、定義內(nèi)源性生物活性物質(zhì)是指人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)天然存在的具有生理功能和生物學(xué)活性的物質(zhì)，它們可以是小分子化學(xué)物質(zhì)，也可能是糖類、生物活性肽類、核苷和核酸、生長(zhǎng)因子、內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)等。2、研究意義 許多重大的突破都是由于發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)那些具有重要生理活性的物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)這些物質(zhì)的其它相關(guān)物質(zhì)。基因克隆使“ 受體一指導(dǎo)” 和 “ 酶一指導(dǎo)” 的新藥的發(fā)現(xiàn)在方法學(xué)上得到完善。D NA 重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展已使蛋白質(zhì)和肽類藥物的生產(chǎn)及其它內(nèi)源性分子作為新藥成為可能。2蛋白質(zhì)類內(nèi)源性活性物質(zhì)的分析3Western Blot Wester

2、n Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。4熒光探針定義： 與蛋白質(zhì)、核酸(DNA或RNA)或其他大分子結(jié)構(gòu)非共價(jià)相互作用而使一種或幾種熒光性質(zhì)發(fā)生改變的小分子物質(zhì)?？捎糜谘芯看蠓肿游镔|(zhì)的性質(zhì)和行為。 5熒光探針 熒光探針除應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、DNA電泳、核酸分子雜交、定量PCR技術(shù)以及DNA測(cè)序上都有著廣泛的應(yīng)用。 可以分為熒光素類探針、無機(jī)離子熒光探針、熒光量子點(diǎn)

3、、分子信標(biāo)幾類6與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的內(nèi)源性活性物質(zhì)對(duì)心肌細(xì)胞功能和形態(tài)的影響7免疫組織化學(xué)法 免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 免疫化學(xué)技術(shù)近年來得到迅速發(fā)展。50年代還僅限于免疫熒光技術(shù)，50年代以后逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實(shí)用的免疫酶技術(shù)。8免疫組織化學(xué)染色法 免疫組

4、織化學(xué)染色法是指在抗體上結(jié)合螢光或可呈色的化學(xué)物質(zhì)，利用免疫學(xué)原理中抗原和抗體間專一性的結(jié)合反應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞或組織中是否有目標(biāo)抗原的存在，此方式不只可以用來測(cè)知抗原的表現(xiàn)量也可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。只要是能夠讓抗體結(jié)合的物質(zhì)，也就是具有抗原性的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、病原體等都可偵測(cè)。 9免疫組織化學(xué)染色法 免疫組織化學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于專一性、靈敏度、簡(jiǎn)便快速以及成本低廉，所以廣為醫(yī)院采用，通常是借由特定的腫瘤標(biāo)記來篩選癌癥。免疫組織化學(xué)染色法對(duì)基礎(chǔ)研究及預(yù)防和診療上都是相當(dāng)重要的一個(gè)方法。10發(fā)光免疫測(cè)定luminescence immunoassay;LIA;luminescent immun

5、oassay 將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測(cè)抗原或抗體的技術(shù)。 以發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后引發(fā)發(fā)光反應(yīng)，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)抗體或抗原進(jìn)行的測(cè)定。 11層析 chromatography 基于不同物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術(shù)。當(dāng)流動(dòng)相(液體或氣體)流經(jīng)固定相(多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體)時(shí)，各組分沿固定相移動(dòng)的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。 層析是應(yīng)用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同而分析分離蛋白質(zhì)的。12雙向凝膠電泳（2D膠電泳）的基本原理先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)在 pH 梯度膠內(nèi)進(jìn)行等電聚焦，然后按照它們的相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行

6、 SDS第二次電泳分離。第一向進(jìn)行等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。移動(dòng)過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動(dòng)的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn) pH 位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍讛U(kuò)散到低于其等電點(diǎn) pH 區(qū)域時(shí)，帶正電荷，在電場(chǎng)的影響下重新向陰極移動(dòng)。同樣，如果蛋白質(zhì)擴(kuò)散到高于其等電點(diǎn)的 pH 區(qū)域時(shí)，則帶負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下會(huì)向陽(yáng)極移動(dòng)。根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個(gè)很窄的p

7、H 梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預(yù)制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG 膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。第二向是將在 IPG 膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 SDS凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分離。沿垂直的方向進(jìn)行 SDS電泳（聚丙烯酰氨凝膠電泳），按分子量大小進(jìn)行分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后，得到等電點(diǎn)和分子量的信息。 13IPG 膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成

8、了分布在pH 310不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。142D膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)15細(xì)胞因子的測(cè)定ELISA系列的試劑盒 細(xì)胞因子絕大部分是蛋白質(zhì)，并且一般都用ELISA試劑盒測(cè)定。16ELISA法酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定是主要的測(cè)蛋白的方法17ELISA 的原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種 敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。18基礎(chǔ):抗原或

9、抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留其酶的活性。19測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，洗滌加入酶標(biāo)記抗原或抗體，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。20免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用的可行性由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，尤其采用基因工程方法制備包被抗原來檢測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的EL

10、ISA檢測(cè)儀的使用，使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。21綜上，由于ELISA具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用 。22舉例：多糖蛋白的檢測(cè)ELISA試劑盒法 CRP，肺炎球菌細(xì)胞壁c多糖蛋白，一種急性時(shí)相（期）蛋白，亦稱C反應(yīng)蛋白，正常參考值10mg/L。本身由肝細(xì)胞產(chǎn)生能結(jié)合肺炎球菌細(xì)胞壁糖蛋白，能監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展情況為非特異性的檢驗(yàn)指標(biāo)，很多疾病時(shí)都可以表現(xiàn)出來。23RIA法兒 放射免疫測(cè)定/放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) 24RIA法基本原理： 在放射免疫分析的實(shí)驗(yàn)中，加入超量的標(biāo)記抗原*A

11、g與未標(biāo)記抗原Ag（即：待測(cè)抗原）與較少量的抗體（Ab）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。 如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果所計(jì)量到的結(jié)合物（*Ag-Ab）放射活性較高，表示待測(cè)物的濃度較低。 如果所計(jì)量到的結(jié)合物放射活性較低，則表示待測(cè)物的濃度較高。 藉由標(biāo)準(zhǔn) 曲線圖的分析，可以推算出待測(cè)物的濃度。 25用 ELISA 法及 RIA 法檢測(cè)26活性蛋白及其降解產(chǎn)物的測(cè)定27血漿纖維蛋白原水平與纖維蛋白 體聚合功能的測(cè)定28血漿纖維蛋白原降解產(chǎn)物測(cè)定參考值 5mg/L 意 義 1.增高見于原發(fā)性纖溶癥,DIC(彌散性血管內(nèi)凝血),惡性腫瘤,肝臟疾病,腎臟疾病,肺梗死,白血病,器官移植的排斥反應(yīng)等.29血漿纖維蛋白原降解產(chǎn)物測(cè)定原理 將

12、FDPs單抗色酸干酶標(biāo)板,加入受檢血清,血清中FDPs(抗原)與包被在反應(yīng)板的FDPs單抗結(jié)合,然后再加入酶標(biāo)記的FDPs抗體,與包被的FDPs結(jié)合,最后加入底物顯色,顯色深淺與血清中FDPs含量成正相關(guān),所得的A值可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出血清中FDPs的含量.30炎癥細(xì)胞因子在眾多炎癥細(xì)胞因子中，起主要作用的是TNF- 、IL-1、IL-6、TGF-、IL-8、IL-l0等。 TNF-是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。 IL一6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化

13、，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑。 IL-8能刺激中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化，促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放彈性蛋白酶，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使微循環(huán)血流淤滯，組織壞死，造成器官功能損傷。 31生物活性法兒測(cè)定驗(yàn)證因子具體舉例白介素-2(17到24張)32本法系根據(jù)在不同白介素-2 (IL-2)的濃度下，其細(xì)胞依賴株CTLL-2細(xì)胞存活率不同，以此檢測(cè)IL-2的生物學(xué)活性。 人白介素-2生物學(xué)活性測(cè)定法(CTLL-2細(xì)胞/MTT比色法) 33試劑(1) RPMI1640培養(yǎng)液 取RPMI 1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素

14、105 IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4保存。(2) 基礎(chǔ)培養(yǎng)液 取新生牛血清(FBS) 10ml，加 RPMl 1640培養(yǎng)液90ml。4保存。(3)完全培養(yǎng)液 取基礎(chǔ)培養(yǎng)液100ml，加重組人自介素-2至終濃度400800IU。4保存。34(4) PBS 取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121 15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(lán)(MTT)溶液 取MTT 0.1g，加PBS溶解并稀釋成20ml，經(jīng)0.22pm濾膜過濾除菌。4避光保存。(6)裂解液 15十二烷基硫酸鈉溶液，使用期限不得超過12個(gè)月。C

15、TLL-2細(xì)胞 應(yīng)為偏酸性、略微渾濁液體，傳代后4860小時(shí)用于重組人白介素-2生物學(xué)活性測(cè)定。 35標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取重組人白介素-2生物學(xué)活性測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，按使用說明書復(fù)溶后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至每lml含200IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做2倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)孔。每孔分別留50ul標(biāo)準(zhǔn)品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進(jìn)行。 36供試品溶液的制備 將供試品按標(biāo)示量復(fù)溶后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成每lml約含200IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。做2倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2孔。每孔分別留50ul供試品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下

16、進(jìn)行。 37測(cè)定法 CTLL-2細(xì)胞用完全培養(yǎng)液于37、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)至足夠量，離心收集CTLL-2細(xì)胞，用 RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中配制成每lml含6.O105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，置37、5二氧化碳條件下備用。在加有標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液50ul，于37、5二氧化碳培養(yǎng)1824小時(shí)。 38然后每孔加入 MTT溶液20ul，于37、5二氧化碳培養(yǎng)46小時(shí)后，每孔加入裂解液150ul，于37、5二氧化碳條件下保溫1824小時(shí)。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。混勻細(xì)胞板中的液體，放入酶標(biāo)儀，以630nm為參比波長(zhǎng)，于波長(zhǎng)570

17、nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序或四參數(shù)回歸計(jì)算法進(jìn)行處理。并按下式計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果： 39 DsEs 供試品生物學(xué)活性(IU/m1) = Pr DrEr式中：Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，IUml； Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)； Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)； Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋 倍數(shù)； Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。40基因測(cè)定測(cè)定基因可以更有力的說明基因表達(dá)的內(nèi)源性活性物質(zhì)的存在411、PCR技術(shù)測(cè)基因2、運(yùn)用熒光探針測(cè)定基因（原理見前述）3、免疫組織化學(xué)染色法（原理見前述）42RNA的測(cè)定43小分子化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)441、液質(zhì)連用 液質(zhì)聯(lián)用（HLPC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與