血細胞生長課件

1、第六章 血細胞生長因子類藥物第一節(jié)概述概念對造血功能有調控作用的細胞因子，稱為造血細胞因子。生物學特性 都是糖蛋白，Mr較小人的造血細胞因子基因多數位于第5及7號染色體長臂；造血細胞因子主要通過細胞旁分泌途徑，也可以是自分泌，只有促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是屬于內分泌多肽類生理有效濃度極低，為10-12molL造血調控由多種造血細胞因子、多種調控方式、形成造血調控網絡造血細胞因子具有多能性，協(xié)同作用造血細胞因子必須與靶細胞相應的受體結合，最終作用于基因水平造血細胞因子的作用是調節(jié)造血細胞增殖和分化血細胞因子分類按其對造血調控作用不同又可分為兩大類：造血正調節(jié)因子，其

2、作用為刺激造血，如EPO、SCF、CSF、TPO和IL等；造血負調節(jié)因子，其作用為抑制造血，如干擾素、TNF和TGF-等。第二節(jié)促血小板生成素1.血小板生成素的發(fā)現 早在1958年Kelemen就提出血液中存在一種調節(jié)血小板生成的激素樣物質,并將其命名為TPO,又稱為巨核細胞生長與發(fā)育因子或巨核細胞生成素(MGDF)。20世紀90年代人們在研究小鼠髓性增生性白血病(MPL)病毒癌基因時,克隆了它的同源物,發(fā)現該基因同源物的表達產物是一種細胞因子,主要表達于血小板、巨核細胞和骨髓細胞。Desauvage等用親和層析法純化了豬的MPL癌基因同源物配體,隨后克隆了人的配體,發(fā)現該配體具有TPO特性,

3、就是人們長期以來所尋找的促血小板生成素TPO。2、來源TPO來源于肝、腎和骨胳肌細胞3.基因和分子結構基因：3q26.33-27,長6.2kb,6個外顯子，個內含子ro-TPO:353AA，21AA信號肽TPO：332AA，Mr 68-85kD(因其糖基化量而變化)，糖蛋白，無糖基化時，r 38kD。糖基化對TPO分子的穩(wěn)定，延長體內半衰期起重要作用。內源性TPO：人TPO基因位于3號染色體，相對分子質量為36103基因重組TPO： 332AA，Mr 68-85kD(因其糖基化量而變化)，糖蛋白，無糖基化時，r 38kD。糖基化對TPO分子的穩(wěn)定，延長體內半衰期起重要作用。TPO兩個結構域：E

4、PO樣N端結構域：是由153AA，有完整的TPO活性，與EPO同源，且高度保守。在該區(qū)中有4個Cys，形成兩對二硫鍵。這兩對二硫鍵是維持TPO活性所必需。富糖基化的C端結構域：179AA，有6個N位的糖基化位點,與目前已知的任何細胞因子無同源性。起穩(wěn)定分子，延長半衰期的作用。兩個結構域之間有兩個串聯(lián)的精氨酸連接。4.TPO分子結構改造TPO的活性集中于端結構域：將7,29,85和151位的半胱氨酸分別用丙氨酸替代,4個突變體均無TPO活性。將端切短,表達的一系列的TPO分子(1-231,1-211,1-191,1-171,1-163,1-157,1-151),均有TPO生物活性。TPO(1-1

5、50)僅因缺少了151位的半胱氨酸而完全喪失了生物活性。TPO分子中二硫鍵對TPO的生物活性是必不可少的,C端結構域的任何潛在的糖基化對TPO的受體結合和信號傳導都不是必需的。EPO-TPO（C）融合蛋白：具有EPO生物學活性，延長了EPO半衰期。5.生物學功能（1）體外作用 TPO對巨核細胞的發(fā)育、成熟，最后分化成血小板的整個過程都起作用。體外研究表明TPO可促使巨核系集落形成單位(CFU-MK)增殖,能促進巨核細胞增殖與分化成熟,增加巨核細胞體積以及血小板特異性抗原的表達（2）體內作用 TPO可以促進早期紅系祖細胞，粒細胞-巨嗜細胞系集落形成單位（CFU-GM）和定向巨核系祖細胞（CFU-

6、MK）的增殖。對外周紅細胞無影響，僅對巨核細胞系有特異作用。與EPO、G-CSF、干細胞因子(SCF),及-3等細胞因子協(xié)同作用,共同促進紅系和粒系祖細胞增殖,促使造血細胞干細胞進入增殖周期。TPO的作用機理誘導造血干細胞向巨核細胞分化；刺激巨核細胞增殖和核內復制；增加巨核細胞的胞漿底物，最終形成碎片；促進血小板的生成；釋放功能性循環(huán)血小板6.臨床應用前景治療因癌癥放化療引起的血小板減少癥、干細胞移植后血小板的恢復臨床實驗表明TPO能有效地減輕化療后血小板降低的程度及縮短其減少的持續(xù)時間,促進血小板計數恢復,并減少血小板輸注需求。TPO雖能有效地促進非造血系統(tǒng)腫瘤化療后血小板生成,但對造血系統(tǒng)

7、腫瘤化療后的作用并不理想。在造血干細胞移植的應用方面,40例乳腺癌患者進行自體骨髓移植后使用PEG-rHuMGDF治療,血小板恢復到正常的時間較安慰劑組縮短了5-6,血小板輸注次數減少了48%。但TPO對自體外周血干細胞移植患者無效。7.TPO毒副作用此外,TPO長期或大劑量應用存在以下潛在的毒副作用刺激腫瘤細胞生長與其他細胞因子產生競爭性相互作用骨髓纖維化肝脾腫大等8.臨床應用前景目前進入臨床研究的重組TPO主要有兩種：一種是全長分子的重組人促血小板生長素(rhTPO)另一種是半長分子(聚乙二醇化)的聚乙二醇-重組人巨核細胞生長發(fā)育因子(PEG-rHuMGDF)。 PEG-rHuMGDF的應

8、用使10%的健康志愿者產 生中和性抗體,并能與內源性TPO產生交叉反應,導致血小板減少,因此PEG-rHuMGDF的臨床研究已被中止,而rhTPO則尚無引起抗體產生的報道,其臨床試驗仍在繼續(xù)。來源：腎臟是EPO產生的主要來源，由腎小管基底膜外側的腎小管周圍間質細胞產生。肝臟中Kupper 細胞和骨髓中巨噬細胞也產生EPO。誘導因素：組織缺氧是誘導EPO產生的主要刺激因素，受組織氧分壓的調節(jié)。作用：促進紅細胞系列的增殖、分化和成熟。第三節(jié)：促紅細胞生成素（EPO） 1.簡介腎臟對EPO產生的調控作用在成人體內,EPO絕大部分由腎臟產生,少量來自肝臟(胎兒及新生兒則主要依靠肝臟產生)。機體缺氧是腎

9、臟分泌EPO的基本動力,腎臟通過相應細胞(腎皮質細胞等)感受機體血氧濃度的變化,對EPO的產生進行調控,從而參與紅細胞生成的過程。即一旦機體表現缺氧(由貧血、血容量減少等引起),腎臟便分泌大量的EPO進入血液,隨血液循環(huán)到達骨髓,作用于造血干細胞,促使紅細胞增生,直到紅細胞的攜氧量達到機體正常水平;而當機體接受血液輸入時,由于大量紅細胞的涌入,導致血氧濃度提高,就會抑制腎臟EPO的產生。2.基因和分子結構人EPO基因：7q1112區(qū)，5.4kb長，有4個內含子和5個外顯子。ro-EPO：l93AA，27AA成熟EPO：166AA,有兩對二硫鍵（7-161，29-33），天然EPO是一種含唾液酸

10、的酸性糖蛋白。由CHO細胞表達的人重組EPO的相對分子質量為30400。分子中60為蛋白質，糖占40。糖基化：EPO的糖基包括3個N-糖鏈(分別位于24、38、83)和一個O-糖鏈(位于Ser126)。它們的主要成分是甘露糖、巖藻糖和唾液酸。其中,唾液酸在維持EPO分子的酸性、防止EPO失活等方面有重要作用。去糖基化不影響EPO體外生物活性，但卻縮短了在體內的半衰期，使其在體內完全喪失活性。因此，糖基化對EPO十分重要。只有在真核細胞中表達的EPO在體內才能發(fā)揮作用。性質：重組EPO對熱穩(wěn)定，在80不變性。能耐受有機溶劑如丙酮，95乙醇。對蛋白變性劑如6molL鹽酸胍，8molL尿素也有耐受性

11、。pI4.5，在pH3.5l0活性穩(wěn)定。對蛋白酶，烷基化及碘化作用敏感。二硫鍵打開后生物活性喪失。EPO制劑不宜凍干，通常制成含蛋白保護劑的水溶液。3.生物學活性(1)促進紅系細胞的生長、分化和增殖，促進紅系池的擴大 紅細胞是由骨髓中的干細胞分化、增殖，再經紅細胞樣爆發(fā)形成單位(BFU-E)和紅細胞樣集落形成單位(CFU-E)、最后作為成熟細胞釋放至血液中的。EPO刺激骨髓中紅細胞樣前體細胞發(fā)生CFU-E和BFU-E。 (2)促進紅細胞成熟 使成熟速度明顯加快，如細胞體積變小，核仁消失，核濃縮，血紅蛋白含量增加等。(3)抗氧化作用 穩(wěn)定紅細胞膜，提高紅細胞膜抗氧化酶的功能。4.EPO臨床應用(

12、1)腎功能衰竭所致的貧血腎性貧血患者EPO水平較低，在進行治療過程中，往往通過注射EPO來提高體內EPO水平進行治療，從而幫助病人增加紅細胞數量，此時EPO水平有所上升。 (2)癌性貧血 (3)結締組織病貧血 (4)骨髓增生異常綜合癥貧血125.其他用途：1、醫(yī)療用途：增加紅血球的數目，用于貧血、組織斷離、早產兒，用在癌學和血液學方面。 2、體育用途(興奮劑)：增加訓練耐力和訓練負荷，屬于國際奧委會規(guī)定的違禁藥物。在2008年北京奧運會中第一例的興奮劑 3、是對紅細胞的生成有增強作用的細胞因子。為分子量6-7萬的糖蛋白，糖的含量多，已證明血和尿中都有它的存在。未分化的干細胞分化成紅細胞系干細胞

13、（erythropoietin responsive cell），促紅細胞生成素在此發(fā)揮作用，使之變?yōu)榍俺杉t細胞。對進一步再成熟為成紅血細胞、網織紅細胞，血紅蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促進作用。一般在貧血和低氧狀態(tài)時，根據身體組織對氧的需要，促紅細胞生成素的供給量將增加，但在腎臟貧血時其含量則非常低。其生成器官和機制雖尚未清楚，可是作為某腎臟因子（renal erythropoietic factor）與血漿的基質反應產生腎小球的說法是有力的。此外，起著相當于促紅細胞生成素作用的因子中，促進白細胞生成的有colony stimulating factor，促進血小板生成的為促血小板生成素

14、，包括促紅細胞生成素在內，統(tǒng)稱為造血促進因子。 6.用法用量： 靜脈注射開始應用較低劑量，每周次，如果在周內，網狀紅細胞計數、血細胞比容和血紅蛋白水平未見明顯增加，本品的劑量可遞增，如果在任何周中血細胞比容的增加大于 以上，本品的劑量應減少，建議以血細胞比容達或血紅蛋白水平達為指標，調節(jié)維持劑量，同時應個別測定最佳血細胞比容的水平。接受長期血液透析的患者，通常在每一次透析過程結束時給予本品。 皮下給藥劑量與靜注相同。 腹膜內給藥劑量等于或大于靜注劑量。 7.EPO的副作用本品的主要副作用為血壓升高和驚厥等，高血壓病人慎用或禁用。使用過量rhEPO對人體造成的傷害:通過促使紅細胞額外增加,紅細胞

15、壓積(Hct)急劇上升,造成血液流動變緩,凝血加快,增加了靜脈血栓、肺栓塞、肌肉感染、中風以及高血壓、癲癇的突發(fā)幾率。偶見瘙癢感、皮疹、痤瘡、GOT或GPT值升高、惡心、嘔吐、眩暈、頭痛、發(fā)熱、血鉀升高等。 血液透析不能控制動脈血壓升高的患者，白血病、鉛中毒及感染患者禁用，有藥物過敏者、變態(tài)反應體質者慎用。應及時對用本品治療者的血壓進行監(jiān)測，必要時給抗高血壓藥物。應注意血管栓塞情況，有時需增加肝素的劑量。必要時補鐵，使患者的轉鐵蛋白飽和度維持在20以上。 由于EPO在體內的作用巨大而天然來源卻十分有限(主要從貧血患者的尿中提取)，人們便開始利用基因重組的分子，它由不同的糖化體構成，各種糖化體的

16、區(qū)別主要表現在糖基在整個分子中所占的比例不同，它一方面能夠刺激骨髓造血功能，及時有效地增加紅細胞的數量；另一方面能夠增強機體對氧的結合、運輸和供應能力，有利于在高強度競技時改善缺氧狀態(tài)，促進肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作時間更長，從而增強運動能力。長期使用rHuEPO，對運動員來說，可能會帶來一時的榮譽，但給其健康帶來的卻是永久的危量過度增加，當血紅蛋白含量超過55時，血液粘滯度就會增高，同時血流也會變慢。加上外界因素如運動脫水、環(huán)境壓力和不合理醫(yī)務監(jiān)督等，當血紅蛋白含量升高至65甚至70以上時，血流速度過慢，引起工作肌缺氧，有可能導致靜脈微血栓形成，從而引起肺栓塞、中風和死亡。8.最新EP

17、O檢測方法（Nature）1988年出現了與天然EPO活性幾乎相同的重組人EPO產品,它能夠改善機體攜氧能力,明顯提高人體的紅細胞數量及血紅蛋白含量,從而提高人體運輸氧的能力,提高人體最大攝氧量,增強人體耐力,對肌體的有氧工作能力有明顯的促進作用,可減少肌體的運動性疲勞,故而有人在比賽或賽馬中濫用,以提高運動成績。因此,從1990年起,國際奧委會( InternationalO lympic Comm ittee, IOC)正式將EPO列為禁用藥物2。血液中正常EPO含量為3.3-16.6mIU/mlEPO興奮劑與人體自然生成的促紅細胞生成素幾乎 沒有區(qū)別，而且半衰期短，注射后會較快地從人體中

18、消失，給檢測增添了難度。弗朗索瓦絲拉納與雅克索里茲教授 長期合作研究后發(fā)現，合成的EPO與人體中自然生成的 EPO在電荷上存在著細微差別，因而可以將二 者區(qū)分。在此基礎上，兩位科學家發(fā)明了準確檢測EPO 興奮劑的新方法。 新方法只需采集被檢者的 幾滴尿液，便可檢測出當事人在天內是否接受過EPO 興奮劑注射。他們進行的測試顯示，新方法具有極高的檢測成功率。rhEPO的氨基酸序列與正常EPO完全相同,僅有糖基部分有微小的差別此,目前可以肯定的rhEPO與EPO在結構上的不同是N-端唾液酸含量差異。分子中所含唾液酸殘基數量的不同,或者胺基化等其它原因引起分子整體電荷的差異。所以rhEPO與正常內源性

19、的EPO相比存在一個較低的負電荷。借助瓊脂糖凝膠柱進行電泳,再利用RIA（熒光免疫分析法）法使各成分在陰極獲得指示并檢出,發(fā)現結果與判斷一致:rhEPO糖化體比正常EPO糖化體晚出峰。該方法在24h以內EPO的檢出率達100%,48h以內達75%。尿樣中EPO比血液中EPO更顯酸性，在電泳速度上會更加有利。注射EPO后，尿樣中EPO的增加比血液中要大。常用瓊脂糖凝膠電泳，等電聚焦，高效毛細血管電泳。目前人們對EPO檢測采取的是直接法與間接法結合使用。2008年,悉尼運會便是采用這一模式,通過血檢加尿檢的方法:首先利用血檢進行粗篩,借助Robin等提出的5項指標取得一個綜合值,將其與正常值比較,

20、挑出可疑者,然后將可疑者的尿樣進行電泳,實施直接檢測。這種模式是目前所能采用的最有效率和說服力的檢測形式,在一定程度上解決了競技體育中EPO檢測的難題。rhEPO的使用會不可避免地導致全血或血清中一些生理生化指標的改變。這些指標包括可溶性轉鐵蛋白受體和與血紅細胞及網織紅細胞相關的各種參數,如紅細胞壓積(Hct)、血紅蛋白含量(Hb)、網織紅細胞壓積(reticulocyte hematocrit,RetHct)、可溶性轉鐵蛋白(sTfr)濃度、血清中EPO濃度及巨細胞百分數(%Macro)等。依賴于對這些間接指標的檢測,與沒有使用rhEPO的正常人的評價結果相比較,可查明運動員是否濫用rhEP

21、O。.EPO生產狀況重組生產： 重組技術生產的rHuEPO是一種酸性糖蛋白，分子量為298士03kDa，于1985年問世并成為注冊藥物。它由啟動子構建成表達載體后，以不同的細胞株有中國倉鼠卵細胞(CH0)、幼倉鼠腎細胞(BHK)及C127小鼠纖維細胞3作為受體進行表達，獲取rHuEPO，所以rHuEPO的氨基酸序列與正常EPO完全相同，僅糖基部分有微小差別。由此可見，rHuEPO與EPO在結構上的不同是N-端唾液酸含量的差異。 -Darbepoetin也稱新紅細胞生成刺激蛋白(novel erythropoiesis stimulating protein，NESP)，其商品名為Aranesp

22、，是一種高糖基化的rHuEPO類似物。Darbepoetin同樣能夠促進紅細胞的產生，并且其不良反應發(fā)生率和死亡率都與rHuEPO相似，但Darbepoetin可能引起的高血壓和凝血事件比rHuEPO少。由于它與禁藥目錄中的EP0有同樣的功效，所以同樣也屬于禁用藥物。Darbepoetin含有5個N一糖鏈和比rHuEPO多的唾液酸殘基。 。與rhEPO不同的是,DPO有5個糖基化位點,而不是3個;DPO的糖基化位點增加,相應的其唾液酸含量也隨之明顯增加,與內源性和基因重組的EPO相比,DPO的唾液酸含量更高。這兩個額外的、包含硅酸的N多糖鏈按順序被放在EP0肽鏈主干的氨基酸位置上，既不改變蛋白

23、質的結構，也不影響與受體的結合。 Darbepoetin的分子量(36804kDa)比rHuEPO大，其糖基含量也由40增加到52。由于糖基含量的增加，它的半衰期比rHuEP0延長2倍，體內的藥效作用時間更長久。并且Darbepoetin有較好的代謝穩(wěn)定性和較長的半衰期，持續(xù)時間比10倍劑量的rHuEPO還要長，所以可以延長給藥的時間間隔，減少給藥次數口，是臨床用藥的又一重大突破。2001年,市場上又出現了一種新近開發(fā)的紅細胞生成刺激蛋白(erythropoiesis stimulating protein,NESP),也稱Darbepoietin-(DPO),它是在促紅細胞生成素分子的基礎上

24、進一步改造形成的,這就賦予了它更長的半衰期和生物活性。表達系統(tǒng)表達載體細胞株與培養(yǎng)過程工藝過程培養(yǎng)工藝控制分離純化過程采用Bellco公司轉瓶機,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分泌RhEPO的工程細胞株CHOEPO-2.所收集的上清液預處理后經染料親和層析-離子交換層析-分子篩層析純化后,所得EPO純度達99%以上,比活性大于1.5105IU/mg,整個純化全過程的EPO體內活性回收率為45%.所純化的EPO分子量為37kD.分析表明,所純化的EPO可與抗EPO的單克隆抗體特異性結合.該工藝純化路線簡單,重復性好,生產成本低,產品活性高,適合大規(guī)模生產重組人促紅細胞生成素.紅細胞生成素，超級“重磅炸彈”基

25、因藥物 1985年科學家應用基因重組技術，在實驗室獲得重組人EPO（rhEPO），1989年安進（Amgen）公司的第一個基因重組藥物Epogen獲得FDA的批準，適應癥為慢性腎功能衰竭導致的貧血、惡性腫瘤或化療導致的貧血、失血后貧血等，其市場表現不俗，1999年銷售值達到17.6億美元，2000年19.6億美元，2002年22.6億美元，2003年24.4億美元，成為名副其實的“重磅炸彈”基因藥物。 安進（Amgen）開發(fā)的用于治療惡性貧血癥的第二代促紅細胞生成素新產品Arnesp2001年得到FDA的批準，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一種“高糖基化”促紅素產品，其促進紅

26、細胞生成的能力大大優(yōu)于第一代EPO（促紅細胞生成素）產品。第一年上市即大獲全勝，贏得開們紅，Aranesp2002年全年銷售額為4.2億美元，2003年全年銷售額為15.4億美元。估計在今后3年內，Arnesp將創(chuàng)造10億15億美元的市場銷售額并奪取現有EPO生產商的部分市場，其市場前景不可估量。 2001年，EPO（包括Arnesp）的全球銷售額達21.1億美元，2002年達26.8億美元，2003年全世界EPO的年銷售額超過50億美元。創(chuàng)下生物工程藥品單個品種之最，是當今最成功的基因工程藥物。 強生（Johnson&Johnson）公司的促紅細胞生成素Procrit/Eprex更是表現不俗

27、，2001年銷售額34.42億美元，2002年銷售額42.69億美元， 2003年銷售收入達到39.84億美元。 目前，國內已有10多家單位獲準生產紅細胞生成素。沈陽三生和上海麒麟鯤鵬（中國）生物藥業(yè)的產品在國內醫(yī)院的銷售額獨領風騷，2001年EPO的國內醫(yī)院銷售總額約為47449萬元，2002年為49508萬元，2003年上半年為28606萬元。估計國內的年市場容量在20到30億元左右，但目前年銷售額只有區(qū)區(qū)5億元左右。 第四節(jié) 集落刺激因子類藥物（CSF）一、集落刺激因子概述最初研究造血干細胞是從軟瓊脂的半固體培養(yǎng)基開始的，在這種培養(yǎng)基中，造血干細胞分化增殖產生的大量子代細胞由于不能擴散而

28、形成細胞簇，稱之為集落，而一些細胞因子可明顯刺激這些集落的大小和數量，因而命名為集落刺激因子（CSF），是一組控制粒細胞，單核-巨噬細胞和某些有關的造血細胞增殖和分化的糖蛋白。 集落細胞刺激因子：能刺激多能造血干細胞和不同發(fā)育分化階段的造血干細胞進行增殖分化，并使之在半固體培養(yǎng)基中形成細胞集落的細胞因子(一)分類：.集落刺激因子（colony Stimulating factor，CSF）根據與粒細胞和巨噬細胞增殖的關系，按生成的集落命名,被分為四種：粒-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、粒細

29、胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor， M-CSF）多潛能集落刺激因子（multipotential-colony stimulating factor multi-CSF），又稱白介素-3（interleukin-3，IL-3）。2.根據CSF刺激細胞所形成克隆的細胞類型特點劃分，分為兩類：作用于造血干細胞:multi-CSF,GM-CSF作用于成熟的造血祖細胞及分化的特殊系列細胞：M-CSF,G-CSFG-CSF主要來源于巨噬細胞

30、、內皮細胞和纖維母細胞。既能高度特異性地刺激中性白細胞系前體細胞的存活、增殖和分化，又是成熟的中性白細胞的功能活化因子。在維持體內中性白細胞水平和活性上起重要作用。GM-CSF主要來源于細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、內皮細胞和纖維母細胞。既能刺激骨髓祖細胞增殖、分化形成粒細胞和巨噬細胞集落，還能刺激嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的前體細胞及早幼紅細胞和多能祖細胞的初期增殖。同時GM-CSF還可以促進成熟造血細胞的產生，增強成熟細胞對細菌和寄生蟲感染的反應能力。M-CSF主要來源于巨噬細胞、纖維母細胞、單核細胞。能增強巨噬細胞的細胞毒性，是集落刺激因子中唯一沒有種間特異性的集落刺激因子。Mul

31、ti-CSF來源于活化的細胞。它作用于更為原始的靶細胞，如作用于一些具有自我更新能力的多能造血干細胞和祖細胞，產生嗜中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和巨核細胞。1981年Ihle等發(fā)現ConA刺激小鼠脾細胞的培養(yǎng)上清中含有一種因子，能提高裸鼠脾臟淋巴細胞成熟淋巴細胞標志20-羥固醇脫氫酶(20-hydroxysteriod dehydrogenase,20SDH)的陽性率，命名為白細胞介素3(interleukin-3,IL-3)。 由于IL-3可刺激多能干細胞和多種祖細胞的增殖與分化，又稱為多潛能集落刺激因子(multi-CSF)。（二）四種CSF的異同點相同點它們

32、都有刺激造血細胞增殖作用，促進非增殖細胞進入增殖周期。這四種集落刺激因子都是低分子量的酸性糖蛋白，相對分子質量約為1400090000。大多都是單鏈多肽（M-CSF除外）基因多位于5號染色體上（G-CSF除外）差異點：人G-CSF基因位于17號染色體上，GM-CSF、multi-CSF和M-CSF基因均位于5號染色體上。各自的產生細胞和靶細胞有一定差別。GM-CSF由T淋巴細胞、單核巨噬細胞、內皮細胞和纖維母細胞產生，靶細胞有中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞。G-CSF由巨噬細胞、內皮細胞和纖維母細胞產生，作用的靶細胞有CFU-G（粒細胞集落形成單位細胞）和中性粒細胞。M-CSF由許多細胞都

33、能產生，其作用的靶細胞有CFU-M（巨噬細胞集落形成單位）和單核、巨噬細胞。multi-CSF是由T淋巴細胞產生，作用于較早期祖細胞，靶細胞有單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，中性粒細胞不表達multi-CSF的受體。 M-CSF是兩條相同肽鏈通過二硫鍵連接的二聚體。G-CSF和GM-CSF生物學作用的異同點(1)G-CSF特異性刺激中性白細胞，而GM-CSF則是所有粒細胞的總刺激因子。若要通過提高嗜酸性效應細胞水平來治療寄生蟲感染，則GM-CSF作用比G-CSF為好。 (2)GM-CSF是單核細胞和巨噬細胞的強激活劑，而G-CSF則不是，如需要提高單核細胞和巨噬細胞活性，可選用GM-CS

34、F，而不是G-CSF。(3)GM-CSF是中性白細胞移動的強抑制劑，而G-CSF則會增強中性白細胞的移動。 當局部損傷時，GM-CSF可在局部產生，起弱的化學誘導劑作用，抑制炎癥細胞離開炎癥部位，而G-CSF則能增強炎癥細胞向炎癥部位移動。二、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）1、誘導和產生：主要由內毒素、TNF-和IFN-活化的單核細胞和巨噬細胞產生。2、基因與分子結構： 基因：17號染色體，與IL-6高同源性。1986年cDNA 克隆成功，.5kb,個外顯子，個內含子。分子結構：人類有兩種不同的G-CSF cDNA，分別編碼含207和204氨基酸的前體蛋白，均有30個氨基酸的先導序列成熟兩種

35、分子形式：174AA 177AA：N端35位處插入3AA，其余序列與174相同，活性提高20倍。 5個Cys（36-42，64-74，17游離） 對17位改造Cys17-Ala17,穩(wěn)定性活性均提高。 Mr21kD3.性質：人G-CSF分子量為19.6kDa，PI6.1，O-糖基化,對酸堿(pH210)、熱以及變性劑等相對較穩(wěn)定。人重組G-CSF的臨床研究證明,它能顯著提高人粒細胞的數量,尤其是在各種原因引起白細胞下降的病人，并且作用迅速,副作用小。但G-CSF也存在體內半衰期短和體外貯藏穩(wěn)定性較差的缺點,影響了它的廣泛應用。許多研究表明,細胞因子不穩(wěn)定因素可能與其結構相關。人G-CSF在17

36、位有一個游離的半胱氨酸和兩個硫鍵(Cys36-Cys42和Cys64-Cys74。 已知白細胞介素-2也有一個游離的半胱氨酸,易形成分子間的二硫鍵,產生無活性的寡聚體。絲氨酸或丙氨酸取代IL-2 Cys125產生的突變克隆具有較高的穩(wěn)定性。利用新的技術路線進行了人重組G-CSF-Ala17的構建和表達, 發(fā)現G-CSF-Ala17較野生型G-CSF除具有更高的穩(wěn)定性外,還具有更高的體內生物學活性。利用定向點突變技術,將人重組粒細胞集落刺激因子第17位游離的半胱氨酸編碼序列突變?yōu)楸彼嵝蛄?。DNA序列分析證明后,在大腸桿菌中表達突變蛋白。利用G-CSF依賴細胞株NFS-60,對在不同溫度及在人血

37、漿中保存的G-CSF蛋白(G-CSF-Ala17)和野生型的G-CSF進行活性測定。腹腔注射后小鼠外周血白細胞計數檢測其體內生物學活性。DNA序列分析表明17位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?并在大腸桿菌中表達成功G-CSF-Ala17。純化的突變蛋白對NFS-60細胞具有刺激活性;與野生型G-CSF相比,在各種溫度儲存的突變蛋白保留更高的活性,與人血漿孵育50小時后突變蛋白仍保持活性;小鼠一次性體內注射突變蛋白后外周血白細胞數明顯高于野生型G-CSF。G-CSF突變體(G-CSF-Ala17)較野生型的G-CSF具有更高的體外穩(wěn)定性和體內造血刺激活性G-CSF-Ala17突變體蛋白, 體外比活性與野生

38、型G-CSF相比,雖然活性相同,但前者的體外穩(wěn)定性明顯改善,并且體內生物學活性明顯增加。G-CSF-Ala17在減少游離半胱氨酸后,不僅提高了結構的穩(wěn)定性,而且具備了較強的抵抗外界影響的能力,特別是在血漿中的抗降解能力,提示其在體內可能有延長半衰期的作用。G-CSF-Ala17有可能作為新一代的基因工程藥物,更利于生產、貯藏和運輸,并且由于其體內半衰期的延長,可減少使用劑量和延長用藥間隔,并降低副作用,因而可能具有良好的開發(fā)應用前景。4.生物學功能G-CSF主要作用于中性粒細胞系造血細胞的增殖、 分化和活化。在體外G-CSF刺激骨髓造血祖細胞中中性粒細胞集落的形成，延長成熟中性粒細胞的存活時間

39、，活化中性粒細胞。最近研究表明，單獨G-CSF或與SCF協(xié)同可促進多能造血干細胞的增殖、干細胞母細胞集落形成。G-CSF還具有對人粒細胞、單核細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及成肌纖維細胞的趨化作用。腫瘤患者注射G-CSF后可提高血循環(huán)中中性粒細胞的水平， 這種作用可能與縮短某些骨髓細胞進入S期的時間以及增加生成粒細胞的祖細胞數量有關。1）對多能造血干細胞的作用：縮短多能造血干細胞的靜止期，誘導其進入細胞周期。與IL-3作用疊加，促進干細胞集落的形成2）對粒細胞、巨噬細胞系前驅細胞（CFU-GM）的作用：促進骨髓粒細胞系的早幼粒細胞的增殖、分化及成熟提高中性粒細胞堿性磷酸酶（NAP）活性促進中性

40、粒細胞及干細胞釋放于外周血中3）提高中性粒細胞機能作用：增強對成熟紅細胞補體受體膜表達；提高對外來異物的粘著能力；4）對單核細胞作用：誘導單核細胞的游走；5）對血管內皮細胞的作用：誘導血管內皮細胞的游走及增殖，與組織修復相關。5.臨床應用放化療后中性白細胞減少癥慢性白細胞減少癥骨髓移植其它6、不良反應（1）骨痛應用G-CSF每日5g/kg后，有1539%病人產生骨痛（2）流感樣癥候群包括發(fā)熱、肌痛、乏力、頭痛、惡心、嘔吐、關節(jié)痛、厭食、腹瀉等。糖基化制劑比非糖基化制劑不良反應少。（3）毛細血管滲漏綜合癥發(fā)生較少，偶見體液潴留、漿膜腔積液、低血壓、呼吸困難、血栓形成等。（4）其它 少數病人可出現

41、皮癥、血小板減少、局部注射處反應等。在白血病發(fā)作期，骨髓有大量白血病細胞時不宜應用。7.G-CSF的生產1991年FDA批準進入臨床1997年我國批準臨床使用 重組人粒細胞集落刺激因子（rHuG-CSF）是將人粒細胞集落刺激因子基因與載體重組，再轉化進入大腸桿菌或CHO細胞后的表達產物。由E.coli表達的非糖基化G-CSF，由175個氨基酸組成，N-端多一個甲硫氨酸,生物活性與天然G-CSF完全相同。用CHO細胞或家蠶細胞和幼蟲表達G-CSF，具有糖鏈，在體內更穩(wěn)定。三、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）1、發(fā)現1977年Burgess等從小鼠肺條件培養(yǎng)液中發(fā)現一種能刺激粒細胞和巨噬

42、細胞形成集落的因子，命名為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。1984年和1985年小鼠和人GM-CSF的cDNA分別克隆成功。2、誘導與產生T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內皮細胞、成纖維細胞等均可產生GM-CSF。其中T細胞和巨噬細胞一般在免疫應答或炎癥介質刺激過程中直接產生，而內皮細胞、成纖維細胞可能通過IL-1和TNF的誘導而產生。人的IL-4、IL-5、M-CSF、M-CSF受體(C-fms)和早期生長應答基因-1(early growth response gene-1,EGR-1)也位于第5號染色體的長臂。表4-6 人第5號染色體上某些生長因子、受體和CD抗原的基因細胞因子IL-3

43、、IL-4、IL-5、IL-13、M-CSF、GM-CSF、ECGF（內皮細胞生長因子）受體M-CSFR(C-fms)、PDGFRCD抗原CD14、CD49a、CD49b其它EGR-13、基因和分子結構基因： 人和鼠GM-CSF基因DNA序列有高度同源性，基因組約2.5kb長，包括4個外顯子和3個內含子。小鼠GM-CSF基因位于11號染色體。而人的則位于第5號染色體長臂，在IL-3基因下游9kb處。分子結構：人和小鼠GM-CSF分別由144和141氨基酸殘基組成，均包含17氨基酸的先導序列。成熟的人和小鼠GM-CSF分子分別由127和124個氨基酸殘基組成，在氨基酸水平上有54同源性，但生物學

44、作用具有種屬特異性。GM-CSF含有高度保守結構的2個鏈內二硫鍵，其中51與93位之間形成的二硫鍵對該因子的生物學活性有重要作用。性質：重組GM-CSF pI 5.4。 4.結構特點：1-96含有與受體結合部位97-121對于穩(wěn)定1-96位與受體結合有重要作用。110-127含有與受體結合的重要部位。GM-CSF分子中第1618，2131和7894氨基酸殘基對刺激造血功能極為重要。糖基化程度不同的GM-CSF生物活性無明顯不同，也有報道，大腸桿菌表達的非糖基化GM-CSF比真核細胞表達的GM-CSF具有更高的生物活性。不同重組表達體系的表達量的比較：目前常用表達體系：大腸桿菌：包涵體形式，分泌

45、型表達(表達量，20mg/L），加工步驟較為繁瑣。酵母菌：將GM-CSF基因克隆到信號肽基因下游，用定位突變的方法除去之間的連接序列，在啟動子調控下，于酵母中表達并分泌到胞外，表達量可達50-60mg/L。哺乳動物細胞：表達量低，難于大規(guī)模生產。不同表達體系GM-CSF生物學活性比較三種體系表達的GM-CSF主要區(qū)別在于N-位點及O-位點的糖基化。E.coil-GM, N-位點及O-位點均未糖基化，Mr14.6kD，在升高白細胞和中性粒細胞恢復方面有優(yōu)勢，短時間用藥，不產生抗體，長時間連續(xù)用藥產生抗體，其抗體與內源性GM-CSF起交叉反應。Yeast-GM,僅N-位點糖基化， O-位點均未糖基化， Mr15.6-30kD，毒副作用較輕，在升高白細胞和中性粒細胞恢復方面有同上的優(yōu)勢，用藥產生的抗體與內源性GM-CSF不發(fā)生免疫反應。CHO-GM， N-位點及O-位點均糖基化Mr18-24kD，用藥產生的抗體與內源性GM-CSF不發(fā)生