高效液相色譜分析法課件

1、第二十章高效液相色譜分析法一、高效液相色譜法的主要類型和原理二、高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇三、高效液相色譜儀四、高效液相色譜分析方法high performance liquid chromatograph2022/7/30一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatograph2022/7/30 概述高效液相色譜法（high performance liquid chromatography；HPLC）是在60年代末，以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論與實驗方法，發(fā)展而成的分離分析方法。它與經(jīng)典液相色譜法的主要區(qū)別是：流動相改為高壓輸

2、送、采用高效固定相、具有在線檢測器、儀器化。2022/7/30二、高效液相色譜法的特點 feature of HPLC 特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2022/7/30一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典LC 與HPLC的主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動相 柱效低（H，n） 分析周期長 無法在線檢測2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合 pH3.0 腐蝕柱子3）適用：極弱酸堿物質(zhì) pH=37弱酸；pH=78弱堿；兩性化

3、合物2022/7/303、容量因子及其影響因素組分為弱酸時：流動相pHpKa，k值變小， tR 減小。組分為弱堿：流動相pHpKb，k值增大，tR增大;流動相pHpKb，k值變小， tR 減小。流動相的pH需在28之間，超出此范圍可能使鍵合基團脫落。實驗后，應(yīng)及時用不含緩沖鹽的流動相沖洗，以防腐蝕儀器流路系統(tǒng)。 2022/7/304、用途有機弱酸、弱堿與兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時的分離。不適用于pka8.0的堿。離子抑制色譜法與離子對色譜法比較ISCPICpka3.0的酸pKa 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚

4、 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)2022/7/305. 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2022/7/30一) 流動相對分離的影響高效液相色譜中，良好的固定相容易獲得，改善分離效果主要是靠選擇流動相。主要受溶劑種類的影響；k主要取決于溶劑的配比

5、。2022/7/30二) 溶劑的強度和選擇性1. 溶劑的極性和強度2. 混合溶劑的強度3. 溶劑的選擇性2022/7/30Snyder溶劑分類法樣品組分、溶劑與固定相三者間的作用力為分子間作用力，組分的分配系數(shù)由三者的分子間作用力所決定。分子間的作用力可分為以下三類：質(zhì)子受體作用力 參照物：乙醇質(zhì)子給予作用力 參照物：二氧六環(huán)強偶極作用力 參照物：硝基甲烷選擇以上作用力最強的常用溶劑作為參照，將81種常用溶劑分為八類。2022/7/30Snyder溶劑分類法選擇不同組別的溶劑，分子間作用力不同，容易造成組分間的分配系數(shù)的差別，使改變，以利于組分的分離。根據(jù)各類參照物推算出常用溶劑的極性參數(shù)P/

6、和反相洗脫溶劑的強度因子S值。選擇不同極性參數(shù)P/的溶劑（正相）或不同強度因子S的溶劑（反相）進行配比，優(yōu)化分離效果。2022/7/30三)溶劑最優(yōu)方法-四面體優(yōu)化法根據(jù)色譜類型（正、反相）組成四面體；尋找被分離組分的容量因子k=3的等洗脫面ABC；將此等洗脫面視為正三角形按比例配制等洗脫強度的初試溶劑。用初試溶劑作為流動相，進樣，檢查分離效果，選擇最好的溶劑系統(tǒng)。2022/7/30色譜溶劑系統(tǒng)的四面體優(yōu)化法ABC0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67BDB/A/C/

7、AC2022/7/30應(yīng)用實例11種磺胺混合物的分離組成溶劑四面體甲醇、乙腈、四氫呋喃底劑：水B水乙腈甲醇四氫呋喃AC2022/7/30應(yīng)用實例11種磺胺混合物的分離尋找等洗脫強度面用ODS鍵合相柱與甲醇-水，分離上述混合物。經(jīng)數(shù)次調(diào)整配比，在甲醇-水（20.0:80.0）時，樣品中保留時間適中組分的k=3（或25）。 tR=t0(1+k)該號溶劑強度因子：Sab=3.00.2+00.8=0.6所有配比溶劑系統(tǒng)的強度因子都為0.6。2022/7/30應(yīng)用實例11種磺胺混合物的分離MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33

8、/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67按比例配制等洗脫強度的初試溶劑2022/7/30應(yīng)用實例MeOH-H2O(20:80)CAN-H2O (18.8:81.2)THF-H2O (13.3:86.7)MeOH-CAN-H2O (10.0:9.4:80.6)ACN-THF-H2O (9.4:6.6:84.0)MeOH-THF-H2O (10.0:6.6:83.4)MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0

9、.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.672022/7/30應(yīng)用實例11種磺胺混合物的分離用初試溶劑作為流動相，進樣，檢查分離效果最佳流動相： MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)2022/7/30洗脫方式恒組成溶劑洗脫用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫在一個分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比。優(yōu)點： 縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度。缺點： 有時引起基線漂移；重復(fù)性不佳。2022/7/30續(xù)前 1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫） 以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵） 類似G

10、C的等溫度洗脫2）梯度洗脫： 在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例 即不斷改變其極性（兩個泵） 適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分 類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）2022/7/30三、分離條件的選擇1 2022/7/30影響分離的因素 factors influenced separation1. 影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。2022/7/30 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)

11、阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。2022/7/30 2.流速 流速大于0.5 cm/s時, Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。 3.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。2022/7/30一)高效液相色譜法的速率理論1.2022/7/30一)高效液相色譜法

12、的速率理論HPLC是將LC與GC基本原理和實驗方法相結(jié)合而產(chǎn)生。兩者主要差別是流動相性質(zhì)不同Van Deemter方程式： GC H=A+B/u+Cu 毛細(xì)管開口柱 H=B/u+Cu HPLC H=A+Cu （流動相是液體，粘度比氣體大的多，柱溫為室溫，而且流速至少是最佳流速的3-5倍，綜上原因可忽略縱向擴散項）2022/7/30圖示back2022/7/30影響HPLC色譜峰寬的因素渦流擴散項AA=2dp降低固定相直徑dp (3-5m)降低。采用球形、仄粒度分布（RSD5%）固定相及勻漿裝柱。2022/7/30影響HPLC色譜峰寬的因素縱向擴散項縱向擴散系數(shù):因流動相黏度大,組分的縱向擴散系

13、數(shù)很小,縱向擴散項可以忽略.2022/7/30影響HPLC色譜峰寬的因素傳質(zhì)阻抗系數(shù)C GC C=Cs HPLC C=Cm+Csm+Cs化學(xué)鍵合相，固定液為鍵合在載體表面的官能團的單分子層 HPLC C=Cm+CsmVan deemter方程在HPLC中的表現(xiàn)形式： HPLC H=A+Cmu+Csmu2022/7/30續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項及其影響 2022/7/302022/7/30HPLC分離條件的選擇采用小粒度、仄分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相，用勻漿法裝柱。采用低粘度流動相，低流量（1ml/min）。柱溫以25為宜。太低，則使流動相的粘度增加。用水溶液為流動相的色譜法（如IEC）可按需升

14、溫。2022/7/30其他(自學(xué))正相鍵合相色譜的分離條件反相鍵合相色譜的分離條件反相離子對色譜的分離條件2022/7/30四 其他固定相(自學(xué))鍵合型離子交換劑手性固定相親合色譜固定相2022/7/30五、分離類型選擇 choice of separation types2022/7/30第二十章高效液相色譜分析法一、輸液系統(tǒng)二、分離與進樣系統(tǒng)三、檢測系統(tǒng)四 數(shù)據(jù)記錄處理和 計算機控制系統(tǒng)第三節(jié)高效液相色譜儀high performance liquid chromatograph2022/7/30一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatograph2

15、022/7/30液相色譜儀（2）2022/7/30液相色譜儀（3）2022/7/30液相色譜儀（4）2022/7/302022/7/30二、高效液相色譜儀2022/7/30三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.流程2022/7/30第三節(jié) 高效液相色譜儀微機泵貯液瓶檢測器記錄器級分收集器預(yù)柱分析柱柱恒溫箱自動進樣器進樣器進樣2022/7/30一、高壓輸液泵(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之

16、一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2022/7/30一、高壓輸液泵1、柱塞往復(fù)泵2022/7/30輸液泵的要求：無脈沖、流量恒定、流量可以自由調(diào)節(jié)、耐高壓、碉腐蝕、適于進行梯度洗脫2022/7/30(2)梯度淋洗裝置外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/7/30二、分離和進樣系統(tǒng)完整的分離和進樣系統(tǒng)包括進樣器、色譜柱、柱的進出口接頭及至檢測器的導(dǎo)管。1、進樣器 六通進樣閥2022/7/301. 進樣裝置 流路中為

17、高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/7/302022/7/30(4) 高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/7/30二、色譜柱2、色譜柱 分析型：內(nèi)徑24.6mm，柱長1025cm 制備型：內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm3、色譜柱柱效的評價 “色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗”給出分析狀態(tài)下色譜柱最小理論塔板數(shù)、分離度和拖尾因子。2022/7/30(5) 液相色譜檢測器2022/7/30三、檢測系統(tǒng)一) 檢測器的要求：靈敏度高;噪聲低;線性范圍寬;重復(fù)性好;適用化合物的種類廣。2

18、022/7/30三、檢測系統(tǒng)可變波長型檢測器光電二極管陣列檢測器2022/7/30覆盆子指紋譜圖2022/7/30板藍(lán)根指紋圖譜2022/7/30三、檢測系統(tǒng)二)、紫外檢測器UVD優(yōu)點：靈敏度高，噪音低，不破壞樣品可用于制備，對溫度及流動相流速波動不敏感，可用于梯度洗脫。缺點：只能檢測有紫外吸收的樣品；流動相選擇有一定限制，檢測波長必須大于流動相的截止波長。2022/7/30二) 紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。 特點： 靈敏度高； 工作原理為Lamber-Beer定律 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選

19、，易于操作； 可用于梯度洗脫。 2022/7/301. 可變波長檢測器原理與紫外分光光度計類似.2022/7/30可變波長紫外光測定器示意圖2022/7/302. 光電二極管陣列檢測器 紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/7/302022/7/30光電二極管陣列檢測器2022/7/30三) 熒光檢測器（fluorescence detector） 高靈敏度、高選擇性； 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；2022/7/30四). 示差折光檢測器（d

20、ifferential refractive index detector） 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2022/7/30示差折光檢測器2022/7/30五) 其他檢測器1. 安培檢測器2 蒸發(fā)光散射檢測器2022/7/30 第二十章 高效液相色譜 法一、定性分析方法二、定量分析方法三、高效液相色譜 分離方法的選擇 第四節(jié) 高效液相色 譜分析法high performance liquid chro

21、matograph2022/7/30第四節(jié)高效液相色譜分析方法一、定性分析方法色譜鑒定法化學(xué)鑒定法兩譜聯(lián)用鑒定法兩譜聯(lián)用法（離線）兩譜聯(lián)用儀（在線）2022/7/30二、定量分析方法(與GC類似)1、外標(biāo)法以待測組分的純品作對照物質(zhì)，對比求算試樣含量。工作曲線法、外標(biāo)一點法、外標(biāo)二點法進樣量必須準(zhǔn)確，否則宣布誤差大。外標(biāo)一點法只有在工作曲線通過零點時才準(zhǔn)確。2022/7/30二、定量分析2、內(nèi)標(biāo)法工作曲線法內(nèi)標(biāo)一點法內(nèi)標(biāo)二點法內(nèi)標(biāo)對比法校正因子法。2022/7/30三、分離方法的選擇 choice of separation types2022/7/30 第二十章 高效液相色 譜分析法一、超臨

22、界流體色譜的特點與原理feature and principle of SFC二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程structure and general process of SFC 三、超臨界流體色譜的應(yīng)用application of SFC 第五節(jié) 超臨界色譜high performance liquid chromatographsupercritical fluid chromatograph, SFC2022/7/30一、超臨界流體色譜的特點與原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.概述 超臨界流

23、體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點:（1）可處理高沸點、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。2022/7/302. 超臨界流體性質(zhì)（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴散系數(shù)位于兩者之間。（2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。2022/7/303.原理 SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離； 通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；2022/7/30壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）； 超臨界流體的