臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)第二十一章 MHC與HLA檢測(cè)及應(yīng)用

1、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技師考試輔導(dǎo)臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)帑醫(yī)學(xué)教育網(wǎng) HYPERLINK 第二一章MHC與HLA檢測(cè)及應(yīng)用本章要點(diǎn)MHC的一般特性HLA分型HLA分型的實(shí)際應(yīng)用組織相容性是指器官或組織移植時(shí)供者與受者相互接受的程度，如相容則不互相排斥，不相容就會(huì)出現(xiàn) 排斥反應(yīng)。誘導(dǎo)同種移植排斥反應(yīng)的抗原稱為組織相容性抗原，也稱為移植抗原。一組對(duì)人和各種哺乳動(dòng)物 中誘導(dǎo)排斥反應(yīng)起決定性作用的抗原稱為主要組織相容性抗原（MHA）。控制主要組織相容性系統(tǒng)（MHS）的 基因包括幾個(gè)不同位點(diǎn)，集中分布于各種動(dòng)物某對(duì)染色體上的特定區(qū)域，是一組緊密連鎖的基因群，這組 基因群稱為主要組織相容性復(fù)合體（MHC）。第一節(jié)MH

2、C的一般特性概念：主要組織相容性復(fù)合體（MHC）是一組存在于各種脊椎動(dòng)物某對(duì)染色體特定區(qū)域的基因。MHC編碼 的基因產(chǎn)物為主要組織相容性抗原（MHA）。人類的MHC即HLA基因復(fù)合體位于人的第6對(duì)染色體的短臂上，是目前已知最復(fù)雜的人類基因系統(tǒng)。I、 II、III三類基因。HLA由400萬堿基組成，傳統(tǒng)上分為I、II、III三類基因。I類：包括經(jīng)典LA-A、B、C， 非經(jīng)典的HLA-E、F、G、H、X等；II類：包括經(jīng)典的HLA-DP、DQ、DR，非典型的HLA-DN、D0、DM等；III類： 位于HLA-I、II類之間，由一些與補(bǔ)體和某些炎癥因子編碼相關(guān)的基因組成。截止到l999年，已知的HL

3、A 等位基因數(shù)已超過l000個(gè)，且數(shù)量仍在繼續(xù)增加。HLA基因復(fù)合體所表達(dá)的基因產(chǎn)物，除直接構(gòu)成同種異體移植排斥反應(yīng)的靶抗原外，在免疫應(yīng)答的過程 中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，也反映著自身免疫性疾病的基因易感性。一、MHC- I類分子MHC-I類抗原是一組由非共價(jià)鍵連接的異二聚體分子，在人類包括HLA-A、B、C、HLA-E、F、G、H、X等。I類分子可廣泛地表達(dá)于各種組織的有核細(xì)胞上，以淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞表面的表達(dá)密度最高，肝、腎、 皮膚、主動(dòng)脈和肌細(xì)胞次之，成熟的紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞不表達(dá)。血清與其他體液中少量存在。I類分子的表達(dá)受到多種因素的調(diào)節(jié)，如IFN-a、&、Y等細(xì)胞因子可促進(jìn)其表達(dá)

4、；腫瘤細(xì)胞表面I類 分子表達(dá)的減少或缺失，即為腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視的重要機(jī)制。二、MHCTI類分子人類MHC-II類分子是由兩條非共價(jià)鍵結(jié)合的多肽鏈組成的異二聚體。a鏈和P鏈均系HLA基因表達(dá)的 產(chǎn)物。包括抗原多肽結(jié)合區(qū)和Ig樣區(qū)，由a l、a 2、& l、& 2四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。MHC-II類分子的分布較窄，主要存在于B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、DC等細(xì)胞上，血清、精液及乳汁等體 液中也可檢測(cè)到。胰島&細(xì)胞和甲狀腺細(xì)胞在病理情況下亦能表達(dá)。胰島素、甲狀腺素、雄激素、TNF-a、IFN-y、IL-1、IL-2、IL-6、GM-CSF等，可促進(jìn)II類分子的表達(dá); 而前列腺素、糖皮質(zhì)激素等則可抑制

5、其表達(dá)。二、MHC-I類分子至少有36個(gè)基因定位于MHC-I類區(qū)內(nèi)，表達(dá)產(chǎn)物主要包括兩類，一類是與免疫應(yīng)答相關(guān)的C4、C2、Bf、 TNF、HSP70等蛋白分子，可參與炎癥和應(yīng)急反應(yīng)，與內(nèi)源性抗原的加工提呈相關(guān)。另一類是與免疫無明顯關(guān)聯(lián)的纈氨酰tRNA合成酶、類固醇21-羥化酶及一些富含脯氨酸的蛋白質(zhì)分子。m類分子不是表達(dá)于細(xì)胞表面的膜分子，而是分布于血清及其他體液中的可溶性分子。第二節(jié)HLA分型HLA的多態(tài)性通過一系列特異性抗體確定，檢測(cè)方法有血清學(xué)分型、細(xì)胞學(xué)分型和分子生物學(xué)分型方法。 HLA分型使HLA復(fù)雜的多態(tài)性更得以顯露，推動(dòng)了 HLA與群體及自然選擇關(guān)系的研究，促進(jìn)了人們對(duì)疾病本

6、質(zhì)的認(rèn)識(shí)。HLA分型應(yīng)用于器官移植、法醫(yī)鑒定、遺傳學(xué)研究以及探討與疾病的相關(guān)性等領(lǐng)域。一、血清學(xué)分型法方法：補(bǔ)體依賴的微量細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）。分型抗原：SD抗原，包括HLA-A、B、C、DR、DQ。（一）原理標(biāo)準(zhǔn)血清+淋巴細(xì)胞，形成抗原抗體復(fù)合物，加入補(bǔ)體，在補(bǔ)體的作用下，細(xì)胞被溶解。溶解的細(xì)胞可被 加入的染料（臺(tái)盼藍(lán)、伊紅）著染，即為陽性反應(yīng)，計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)，作出結(jié)果判斷。（二）技術(shù)要點(diǎn)CDC試驗(yàn)的關(guān)鍵在于獲得標(biāo)準(zhǔn)抗血清，與AB0血型抗體不同，主要獲自經(jīng)產(chǎn)婦?？寡宸N類應(yīng)覆蓋本民族、本地區(qū)80%以上的抗原。3.II類抗原，僅分布于B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面，故檢測(cè)II類抗原應(yīng)分純B細(xì)胞。注意下列假

7、象：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞能夠非特異性地，吞噬染料而造成著染假象，應(yīng)注意細(xì)胞形態(tài)的 區(qū)別。血小板與淋巴細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)，結(jié)合HLA抗體而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，可用玻璃珠脫纖維抗凝。紅細(xì)胞沾染 易致假陽性。單克隆抗體復(fù)合物不能激活補(bǔ)體，不能用于CDC，可改用ELISA、FCM。（三）臨床應(yīng)用HLA配型可用于器官移植與相關(guān)疾病的診斷研究。HLA交叉配型即用CDC法檢測(cè)受體血清有無針對(duì)供者HLA的抗體，以監(jiān)測(cè)排斥反應(yīng)的發(fā)生或估價(jià)受體 的敏感性。群體反應(yīng)性抗體的檢測(cè)（PRA） PRA用于判斷器官移植時(shí)受體的敏感程度。二、細(xì)胞學(xué)分型法細(xì)胞學(xué)分型法是以混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）或稱混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）為基本技術(shù)的HLA

8、分型法。 能用本法分型的抗原稱為L(zhǎng)D抗原，包括HLA-D、DP。（一）單向MLC陰性分型法：又稱為純合子分型細(xì)胞試驗(yàn)（HTC）。純合子是指細(xì)胞內(nèi)一對(duì)同源染色體上兩個(gè)HLA單倍 型完全相同，只表達(dá)一種抗原，可從近親婚配的子代中尋找。陽性分型法：又稱為預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型法（PLT），預(yù)備：選擇只有一個(gè)單倍型不同的兩個(gè)個(gè)體，a /b和a/c，刺激細(xì)胞a/b加反應(yīng)細(xì)胞a/c共育作單向MLC，得到針對(duì)b特異免疫應(yīng)答能力的PLT。依此類 推，可得到一系列識(shí)別各種已知LD抗原的一套PLT。（二）雙向MLC遺傳型不同的兩個(gè)個(gè)體淋巴細(xì)胞在體外混合培養(yǎng)時(shí)，由于兩者HLA不同，能相互刺激導(dǎo)致對(duì)方淋巴細(xì)胞 分裂增殖和

9、分化，稱為雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。三、分子生物學(xué)分型法又稱DNA分型法：靈敏度高，陳舊微量標(biāo)本可檢測(cè)，克服CDC和MLC的不足，前景廣闊。（一）聚合酶鏈反應(yīng)與SSP分型法方法采用一系列設(shè)計(jì)的特異性引物，作HLA基因PCR擴(kuò)增，一對(duì)特異性引物只能擴(kuò)增出結(jié)構(gòu)與其互補(bǔ)的基因 片段，根據(jù)引物擴(kuò)增結(jié)果，能確定檢樣的基因型。評(píng)價(jià)：只需作PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物檢測(cè)，快速簡(jiǎn)便（二）PCR-SS0 分型法序列特異性寡核苷酸-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSO）是PCR與雜交相結(jié)合的技術(shù)。關(guān)鍵：預(yù)先知道II類基因 的核苷酸序列，設(shè)計(jì)出恰當(dāng)?shù)奶结槨Ｔu(píng)價(jià)：需合成大量DNA探針，操作步驟多，適合大規(guī)模分型和配型。（三）RFLP

10、與PCR-RFLP分型法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析，是最早建立的研究HLA多態(tài)性的DNA分型技術(shù)。方法：PCR擴(kuò)增的基因片段一等位特異的內(nèi)切酶消化一切成長(zhǎng)度不一、數(shù)量不等的基因片段一電泳分離， 根據(jù)一系列內(nèi)切酶解格局可確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型。關(guān)鍵：預(yù)知II類基因的核苷酸序列，并據(jù)此找到合適的內(nèi)切酶。評(píng)價(jià)：不需同位素，簡(jiǎn)便，適合小規(guī)模分型。（四）PCR-SSCP分型法單鏈構(gòu)象特異性-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSCP），是以待測(cè)基因PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，對(duì)擴(kuò)增的DNA單鏈進(jìn)行多 態(tài)性分析的HLA分型方法。該法簡(jiǎn)單、快速、精確，已初步應(yīng)用于異基因骨髓移植的配型工作。（五）SBT分型法基于序列

11、的HLA分型法，是一種通過對(duì)擴(kuò)增后的HLA基因片段進(jìn)行核酸序列測(cè)定，從而判斷HLA型別的 方法。方法：PCR擴(kuò)增出的HLA基因片段純化，自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。評(píng)價(jià)：直接、精確、價(jià)格昂貴，主要用于新等位基因的鑒定。第三節(jié)HLA分型的實(shí)際應(yīng)用一、HLA與器官移植HLA分型的應(yīng)用首先與器官移植相關(guān)。MHCI類和II類分子是引起同種異體移植排斥反應(yīng)的主要抗原，供 者與受者M(jìn)HC的相似程度直接反映兩者的相容性，供-受者間的MHC相似性越高，移植成功的可能性越大。移 植前的重要工作就是通過HLA檢測(cè)的方法進(jìn)行組織配型，選擇HLA抗原與受者盡量相同的供者，在移植后發(fā) 生排斥反應(yīng)時(shí)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)拿庖咭种?。二、HLA 與

12、 AID尋找與某些疾病相關(guān)的HLA型別，研究其發(fā)生的遺傳背景，這些疾病中以AID居多。例如胰島素依賴性 糖尿?。喝A人DR9，白人DR4。強(qiáng)直性脊柱炎：B27； SLE： DR3。三、HLA與輸血反應(yīng)非溶血性輸血反應(yīng)與患者血清中存在HLA抗體相關(guān)，可用HLA分型法檢測(cè)供者HLA型別和HLA抗體。四、HLA與法醫(yī)鑒定HLA等位基因的多態(tài)性是個(gè)體的終生遺傳標(biāo)記，無血緣關(guān)系的人群中HLA表型完全相同者極罕見，在同 一家族內(nèi)HLA以單倍型方式遺傳，據(jù)此作親子鑒定、法醫(yī)鑒定。尚可對(duì)極少量的陳舊標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，在法醫(yī) 學(xué)上可用于兇犯身份鑒定和死者身份鑒定。習(xí)題94決定HLA分子多態(tài)的因素是MHC基因上復(fù)等位基

13、因，均共顯性分子有相關(guān)性分子可以分裂分子有交叉反應(yīng)基因連鎖不平衡答疑編號(hào)500728210101正確答案A、E習(xí)題95免疫應(yīng)答抗原與以下哪類分子密切相關(guān)MHC1類分子MHC2類分子MHC3類分子免疫球蛋白補(bǔ)體答疑編號(hào)500728210102正確答案B習(xí)題96組織相容性抗原屬于異種抗原用種異型抗原異嗜性抗原自身抗原外源性抗原。答疑編號(hào) 500728210103正確答案B習(xí)題97最常用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞HLA抗原的方法是補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)凝集試驗(yàn)答疑編號(hào)500728210104正確答案C,D習(xí)題98混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）主要檢測(cè)位點(diǎn)的抗原有HLA-AHLA-BHLA-DPHLA-DRHLA-DQO 答疑編號(hào) 500728210105正確答案C答案解析補(bǔ)體依賴的微量細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）主要檢測(cè)SD抗原，包括HLA-A、B、C、DR、DQ?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)（MLC）主要檢測(cè)LD抗原，包括HLA-D、DP。前者位血清學(xué)分型法，后者為細(xì)胞學(xué)分型