USP35-1116中文

1、1116無菌工藝環(huán)境的微生物控制和監(jiān)測在藥品行業(yè)，微生物控制環(huán)境有多種用途。本章節(jié)提供了關(guān)于通過無菌工藝控制微生物污染的環(huán)境的信息和建議。在這些環(huán)境中生產(chǎn)的產(chǎn)品包括無菌制劑、無菌原料藥、無菌中間體、輔料和部分藥用器械。從患者風(fēng)險的角度來說，無菌工藝環(huán)境比其他生產(chǎn)操作的控制環(huán)境要重要的多，例如設(shè)備和備件的準(zhǔn)備、非無菌產(chǎn)品的生物負荷限度控制和最終滅菌產(chǎn)品工藝。本章節(jié)中的無菌工藝環(huán)境有人和無人操作應(yīng)區(qū)別對待。一個高級無菌工藝是不需要和禁止穿常規(guī)潔凈服的操作人員直接接觸敞口容器或暴露的產(chǎn)品接觸表面的。（注意：本章所用的術(shù)語在章節(jié)最后的目錄里有解釋。）本章節(jié)給出了指導(dǎo)意見和潔凈室、限制進入隔離系統(tǒng)（RA

2、BS）和隔離器等無菌工藝的微生物評價的監(jiān)控參數(shù)，其他不要求在無菌條件下生產(chǎn)的無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)境的污染控制要求可以根據(jù)ISO環(huán)境分類執(zhí)行。非無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)境要有不同的微生物控制等級。大部分標(biāo)有無菌的產(chǎn)品是在無菌工藝條件下生產(chǎn)的而不是最終滅菌。因為無菌工藝不僅生產(chǎn)過程中將微生物從生產(chǎn)用蒸汽中排除，并在空的容器進入時也阻止微生物的進入，還將生產(chǎn)環(huán)境的生物負荷作為一個控制微生物污染的重要參數(shù)。無菌和滅菌并不是一個同義詞。滅菌指的是將全部的微生物或組織進行殺滅，有復(fù)活的可能性。從純粹的微生物意義上說，一個無菌工藝可以通過排除微生物的方式防止污染。在現(xiàn)代無菌藥品制造業(yè)，無菌指的是在一個設(shè)計好的受控環(huán)境中

3、處理已滅菌的物料使微生物污染處于風(fēng)險最小的已知水平。在有人進行操作的任何環(huán)境中，微生物污染在一定程度上是不可避免的。如果有人員存在的話，即使最謹慎的潔凈室環(huán)境設(shè)計和操作也不能避免微生物的掉落。因此在所有無菌生產(chǎn)工藝操作過程的所有場所達到零污染在技術(shù)上是不可能的并且也是不現(xiàn)實的。去證明一個無菌生產(chǎn)工藝的環(huán)境和在這個環(huán)境中產(chǎn)品接觸的表面是已消毒的是沒有意義的。應(yīng)當(dāng)根據(jù)風(fēng)險評估確定監(jiān)測點。雖然生產(chǎn)者會經(jīng)常對環(huán)境監(jiān)測結(jié)果進行回顧以確保生產(chǎn)操作在受控的驗證狀態(tài)，但是監(jiān)測結(jié)果不能證明無菌或非無菌。因為監(jiān)測的局限性，所以生產(chǎn)者不能直接依據(jù)監(jiān)測、統(tǒng)計或定期的無菌工藝模擬來確定滅菌的安全水平。環(huán)境監(jiān)測通常由人來

4、進行，需要操作者的參與，所以環(huán)境監(jiān)測也能增加污染的風(fēng)險和得到假陽性的結(jié)果。因此密集的監(jiān)測是不必要的，尤其是在無菌生產(chǎn)工藝最關(guān)鍵的的IS05級（B級）的環(huán)境中。在無菌生產(chǎn)工藝的微生物狀態(tài)和環(huán)境控制和評價中需要用到一系列的取樣方法。現(xiàn)在幾乎所有的方法都依賴微生物的生長和回收，這些方法中的大多數(shù)都是在環(huán)境應(yīng)力導(dǎo)致的受損的狀態(tài)下進行的，因此是很難恢復(fù)的。本章節(jié)中的空氣、表面和人員的監(jiān)測數(shù)值不用來作為限度或指標(biāo)的要求，只是嚴格的報告數(shù)據(jù)。鑒于微生物取樣工具和方法的多樣性，沒有充分的理由證明獲得這些數(shù)值就能證明微生物的到了控制，或短暫的超出這些數(shù)值，微生物就失去了控制。在一個有意義的周期內(nèi)，必須進行和生產(chǎn)

5、環(huán)境有關(guān)的風(fēng)險評估。在任何情況下，均應(yīng)在回顧實際生產(chǎn)調(diào)查的基礎(chǔ)上確定污染回收率指數(shù)。為了促進改善，應(yīng)當(dāng)用污染回收率追蹤每個使用者連續(xù)進行的性能和確定微生物控制程序。當(dāng)達到一個設(shè)備最有利的操作條件時，污染回收率水平典型地變?yōu)橄鄬Ψ€(wěn)定地在一個正常區(qū)間內(nèi)變化。沒有標(biāo)準(zhǔn)的空氣采樣方法，也沒有可查閱到的文獻方法，表明空氣采樣方法具有高度的可變性。不能假設(shè)相似的采樣體積在不同的方法下能得到相似的回收率。許多參數(shù)都能影響微生物回收率和存活率，不同的空氣采樣器生產(chǎn)商的設(shè)計可能也使他們的系統(tǒng)滿足不同的要求。微生物采樣時樣品間的差異也是很大的。藥品無菌生產(chǎn)工藝監(jiān)測方法的準(zhǔn)確度、靈敏度精密度和檢測限的限值是可以得到

6、的。表面采樣方法同樣也沒有標(biāo)準(zhǔn)化。使用不同的介質(zhì)，在干法、濕法和接觸碟法時能得到不同的數(shù)據(jù)。重復(fù)采樣的接觸碟被認為在相同條件下能得到相似的結(jié)果，但是有報道稱回收率比期望值低并且具有高度的可變性?？傊?，即使在標(biāo)準(zhǔn)取樣片上具有相對高的接種水平，表面監(jiān)測方法的回收率也不到50%。在實際的生產(chǎn)環(huán)境中，微生物因為應(yīng)力而具有變化的情況下，回收率可能會更低。高級無菌技術(shù)高級無菌技術(shù)可以被定義為在生產(chǎn)過程中不依賴人為操作直接干預(yù)的無菌技術(shù)。現(xiàn)在，隔離器技術(shù)、吹灌封一體技術(shù)和封閉的限制進入隔離系統(tǒng)（RABS）（在設(shè)置和操作時新打開）可以被認為高級無菌技術(shù)，這些技術(shù)在生產(chǎn)過程中，不允許更衣人員進行直接干預(yù)。近年來

7、隔離器技術(shù)在制藥業(yè)的得到了廣泛的認可。隔離器和封閉的限制進入隔離系統(tǒng)（RABS）有效地將操作者和關(guān)鍵無菌生產(chǎn)環(huán)境隔離開來。因為這些系統(tǒng)大大地降低了污染的風(fēng)險，所以它們的微生物控制水平比傳統(tǒng)的同等潔凈度級別的潔凈室微生物控制水平高，如IS05級（B級）。無菌生產(chǎn)工藝環(huán)境的潔凈室級別IS014644系列闡述了潔凈室和環(huán)境控制區(qū)的設(shè)計和建造。這個標(biāo)準(zhǔn)用單位體積的總粒子濃度表示潔凈環(huán)境的性能。IS014644-1規(guī)定了不同空氣質(zhì)量級別的潔凈環(huán)境允許的總粒子數(shù)。讀者可以據(jù)此來考慮設(shè)計參數(shù)和建立潔凈環(huán)境。在注射藥品生產(chǎn)過程中藥品生產(chǎn)人員介入了非活體粒子污染（見微粒物質(zhì)788）。在微生物污染中，實驗數(shù)據(jù)證明

8、人是唯一重要的來源，而非活體粒子則不同，既可以由人引入，也可以由生產(chǎn)設(shè)備中引入。研究表明，更衣人員脫落的微粒和微生物污染的比例是相當(dāng)穩(wěn)定的。但是生產(chǎn)設(shè)備脫落的活體和非活體污染之間不存在這樣的關(guān)系。當(dāng)設(shè)備時微粒的主要來源時，微粒主要是非活體。“潔凈室中的總粒子數(shù)越少，空氣中存在微生物的可能性越小”這種說法，只有當(dāng)人是微粒的來源時才能成立。機械操作造成的背景總微粒污染和人員引入的微粒污染之間并不能進行清楚地區(qū)分。因此，潔凈室環(huán)境監(jiān)測由總微粒數(shù)部分和微生物數(shù)部分組成這種做法是比較常見的，也是比較合適的。表1給出了制藥企業(yè)常見的潔凈室等級。在無菌生產(chǎn)工藝中，一般會用到IS014644-1中的5-8級。

9、表1不同潔凈級別的總微粒數(shù)ISO等級0.5口m的微粒數(shù)/m3ISO53520ISO635200ISO7352000ISO83520000注：此表來源于ISO國際標(biāo)準(zhǔn)14644第一部分，由國際標(biāo)準(zhǔn)委員會于1999年5月印刷。ISO14644-1的這四個等級與美國聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209E的等級是一致的，分別是IS05/100級，ISO6/1000級，ISO/10000級，ISO8/100000級。隔離器和封閉的限制進入隔離系統(tǒng)（RABS）則體現(xiàn)了不同的情況，因為人員通過厚的柔軟的塑料（如聚氯乙烯或半合成橡膠）制成的手套和袖管組合和半套衣服進行操作，從而被排除在無菌生產(chǎn)工藝環(huán)境之外。人對隔離器中物品的影響遠

10、小于對潔凈室環(huán)境中物品的影響。一些用戶選擇了一種允許開放和直接人為干預(yù)的方式對RABS進行操作。在一個開放的操作狀態(tài)下，這些系統(tǒng)和普通的潔凈室環(huán)境相似，因此不能被認為是高級無菌工藝系統(tǒng)。在一個開放的RABS中，操作人員的能力對微生物污染的風(fēng)險的反作用比封閉的RABS或隔離器高。ISO14644和聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209E中都沒有包括對每小時換氣次數(shù)和風(fēng)速的規(guī)定。通常IS08/100000級設(shè)計的換氣次數(shù)不低于20次/小時，ISO10000級設(shè)計的換氣次數(shù)應(yīng)超過50次/小時，IS05/100級設(shè)計的換氣次數(shù)應(yīng)超過100次/小時。有些設(shè)施的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)也有所不同。在無菌生產(chǎn)中，為了稀釋和消除污染物，可能需要用大

11、體積的氣體來降低潔凈室的生物負荷污染。因為一部分污染是由人引入的，最適宜的條件也應(yīng)該隨著過程參數(shù)的不斷變化而變化。在潔凈室的設(shè)計和操作中，這些標(biāo)準(zhǔn)只能作為一個指導(dǎo)原則，因為還沒有令人滿意的實驗?zāi)鼙砻髅啃r換氣次數(shù)、體積和微生物控制之間的精確聯(lián)系。生產(chǎn)者應(yīng)使?jié)崈舳葹?級的潔凈室保持一個明顯的單向流（垂直或水平方向），尤其是在產(chǎn)品、產(chǎn)品容器和封口物品暴露時。在潔凈室中評價氣流運動時，采用發(fā)煙裝置或者其他合適的方法肉眼觀察氣體的流向比單純地測量換氣體積和換氣次數(shù)的方法可能要有用的多。風(fēng)險評估模式也被認為是一個可以降低污染風(fēng)險的實用方法。在隔離器和封閉的RABS中換氣體積和換氣次數(shù)遠不如在潔凈室中重要

12、，因為人被很小心地與產(chǎn)品、產(chǎn)品容器和封口用物品分離開了。研究證明在隔離器中足夠的換氣體積和在RABS中合適的換氣體積一般低于有人存在的潔凈室中的換氣體積。隔離器中微粒對產(chǎn)品質(zhì)量有影響的區(qū)域，可以保持一個明顯的垂直或水平方向的單向流。實驗表明，控制良好的混合流或湍流在許多無菌工藝和隔離器的滅菌測試中也能達到滿意的效果（見滅菌測試-隔離器系統(tǒng)驗證）。環(huán)境控制的微生物評價的重要性即使使用電子儀器對環(huán)境控制中的總微粒子數(shù)的進行連續(xù)的監(jiān)測，也未能獲得環(huán)境中微生物濃度的報告。微粒計數(shù)器的根本限制是只能測量粒徑0.5pm或更大的粒子。然而，空氣中的微生物并不是自由漂浮或是單細胞的，它們通常附著在10到20p

13、m的微粒上?？刂骗h(huán)境內(nèi)的微粒計數(shù)也就是微生物計數(shù)隨著取樣點和取樣的不同方式而改變。非活性的微粒和微生物的環(huán)境監(jiān)控是一項重要的控制功能，因為要符合注射劑中的可見異物、不溶性微粒與無菌（注射劑）的要求，兩者的監(jiān)控都是很重要的。相對于傳統(tǒng)的潔凈室而言，在隔離器和封閉的RABS中總微粒數(shù)的監(jiān)測提供了一種更好的環(huán)境質(zhì)量評價方式。在隔離器中，非活性微粒比例增長證明人的污染被很好地得到了隔離。隔離器中總微粒計數(shù)可能會提供一個污染水平變化的直接指示。微生物監(jiān)測程序應(yīng)該對清潔和消毒效果進行評價，并且對監(jiān)測人員對控制環(huán)境的生物負載的影響進行評價。由于隔離器使用自動蒸汽或氣體發(fā)生系統(tǒng)進行消毒，在進行消除生物負荷的效

14、能評價時，微生物監(jiān)測并不十分重要。這些自動消毒系統(tǒng)用合適的生物指示劑挑戰(zhàn)進行直接驗證，并控制常規(guī)使用時的暴露參數(shù)以確?？梢赃_到持續(xù)的消毒狀態(tài)。在這些控制環(huán)境中的微生物監(jiān)測不能也無需進行鑒別和量化所有的微生物污染。從技術(shù)上來講，潔凈室中的微生物學(xué)監(jiān)測是一個半量化的試驗，因為由于取樣器具的局限性，對環(huán)境進行真正的量化評價是不可能的。計數(shù)方法的缺乏和被有效監(jiān)測的采樣體積的限制意味著從環(huán)境監(jiān)測中得到無菌保證的定量信息是不充分的。分析員應(yīng)謹記：即使沒有活的微生物存在，也沒有一種取樣計劃能證明不存在污染。在一個微生物樣品中沒有生長只說明生長沒有被觀察到，不代表環(huán)境沒有污染。常規(guī)的微生物監(jiān)測應(yīng)能提供足夠的信

15、息證明無菌工藝環(huán)境在一個適當(dāng)?shù)目刂茽顟B(tài)下運行。微生物監(jiān)測計劃中的此項真實數(shù)據(jù)證明一直在持續(xù)、高質(zhì)量的環(huán)境條件下運行。監(jiān)測計劃可以對污染回收率的變化進行檢測，從而指示環(huán)境控制狀態(tài)的變化。由具有資格的人員進行的環(huán)境微生物監(jiān)測和數(shù)據(jù)分析時，可幫助確保環(huán)境處于控制的合適狀態(tài)。為了得到有意義的、與過程相關(guān)的數(shù)據(jù)，可以在正常操作過程中應(yīng)對環(huán)境進行取樣當(dāng)原料存放，或在生產(chǎn)活動持續(xù)進行進行，以及操作人員全部在崗時時，應(yīng)對無菌生產(chǎn)工藝環(huán)境進行微生物取樣。潔凈室、隔離器和RABS的微生物監(jiān)測應(yīng)當(dāng)包括壓縮氣體、表面、房間、灌裝氣體和其他物料以及設(shè)施等可能產(chǎn)生污染風(fēng)險的因素。長久以來，在無菌環(huán)境中進行污染趨勢分析的人

16、員都是環(huán)境控制計劃的一部分。在無菌生產(chǎn)工藝環(huán)境尤其是ISO5級環(huán)境中，污染很少被觀察到。在人員污染被很好地排除的隔離器中，更是如此。由于這些環(huán)境的關(guān)鍵性，即使是污染時間的微小變化也可能是有意義的，生產(chǎn)者應(yīng)經(jīng)常和謹慎地回顧監(jiān)測數(shù)據(jù)。在非關(guān)鍵區(qū)域，微生物污染可能較高，但是仍應(yīng)注意、調(diào)查和糾正回收率的變化。在傳統(tǒng)的潔凈室中，微生物的隔離回收應(yīng)該被認為是正常現(xiàn)象，通常這表示不需要進行特別的糾正，因為幾乎可以肯定調(diào)查者不能找到一個被證實的原因。在傳統(tǒng)的潔凈室內(nèi)，由于樣品本身要求無菌，任何一個單獨的沒有關(guān)聯(lián)的的污染事件都可能是假陽性的。當(dāng)污染回收率超過制定的水平時，必須進行工藝和操作調(diào)查。調(diào)查將根據(jù)制造的

17、產(chǎn)品和使用隔離器、RABS和潔凈室等類型而有所不同。調(diào)查應(yīng)當(dāng)包括區(qū)域保持記錄的回顧，消毒記錄、偏差的發(fā)生、內(nèi)在生理或操作參數(shù)，例如環(huán)境溫度的變化和人員的培訓(xùn)情況。在封閉的RABS和隔離器系統(tǒng)中，手套完整性的缺失和偶然引入未經(jīng)消毒的物質(zhì)是可檢測到的污染產(chǎn)生的最可能的原因。通過調(diào)查，必須采取措施糾正或消除可能導(dǎo)致污染的原因。因為在現(xiàn)代的無菌設(shè)施中污染相對稀有，調(diào)查結(jié)果經(jīng)常是無果的。當(dāng)糾正措施實施時，可能包括加強在穿衣、無菌技術(shù)、環(huán)境微生物控制方面的人員培訓(xùn)。也可能會采取一些額外的微生物取樣，但是這在無菌生產(chǎn)工藝中可能并不是合適的，因為增加的或者是過度密集的采樣必定使污染的風(fēng)險變大。只有當(dāng)無菌工藝模

18、擬研究時，額外取樣才時更合適和可取的。其他檢測方法被認為可以更好地控制微生物污染，包括額外的消毒、使用不同的消毒劑和微生物污染和來源鑒別。在任何一個傳統(tǒng)或高級的無菌環(huán)境中，調(diào)查和由于調(diào)查結(jié)果而采取的措施的原因的推理必須謹慎并記錄。污染控制效果的實際評估潔凈環(huán)境應(yīng)當(dāng)按照ISO14644系列中的規(guī)定進行驗收，以達到設(shè)計等級的要求。設(shè)計、結(jié)構(gòu)和操作都能使?jié)崈羰野l(fā)生很大改變，所以很難對參數(shù)如過濾器完整性、換氣體積、氣體類型、換氣和壓差等進行概括歸納，特別是關(guān)鍵的應(yīng)用如無菌工藝結(jié)構(gòu)，接近實際的風(fēng)險評估是比較合適的。LjungquistandReinmuller曾經(jīng)開發(fā)了一個這樣的方法，被稱為L-R方法。

19、通過評價氣體和環(huán)境稀釋和移除空氣攜帶粒子的能力來挑戰(zhàn)通風(fēng)系統(tǒng)。在L-R方法中，有一個發(fā)煙裝置使分析員能夠目視潔凈室或控制環(huán)境中所有區(qū)域的空氣運動，包括渦流和湍流區(qū)域，可以對空氣流的類型可以進行調(diào)整以使不期望的影響降到最小。通過氣流的優(yōu)化，可以在關(guān)鍵區(qū)域和滅菌場所產(chǎn)生微粒。這種評估只能在模擬生產(chǎn)但設(shè)備和人員到位的條件下下進行。這種測試同樣也能用在RABS和隔離器的能力評價上，尤其是在這些系統(tǒng)中的產(chǎn)品出口附近，以防止污染。潔凈室中的空氣運動的目視評價是一個主觀的過程。在有人員和設(shè)備存在的正在運行的潔凈室中完全消除湍流是不可能的?？諝獾目梢暬皇莾?yōu)化潔凈室性能的努力中的一步，并不是確切的通過/失敗測

20、試，因為可接受和不可接受的條件還不明確。在執(zhí)行微生物監(jiān)測程序之前，對潔凈室、RABS和隔離器的實際參數(shù)進行合適的測試和優(yōu)化是必要的。確保潔凈室、RABS和隔離器與預(yù)定的工程標(biāo)準(zhǔn)相符為控制生物負荷的設(shè)備能力和操作實驗提供了可靠保障。非活性微粒被用于預(yù)定用途。在潔凈室和高級無菌工藝系統(tǒng)的驗收時應(yīng)當(dāng)重復(fù)這些測試，并且無論操作如何改變，如人員流動、設(shè)備、操作、物料流動、空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)或設(shè)備的布局安排，都被看成是很有意義的。人員培訓(xùn)良好的人員操作在污染控制過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，合適的培訓(xùn)和監(jiān)督是污染控制的核心，無菌生產(chǎn)的關(guān)鍵活動取決于微生物受控的環(huán)境，生產(chǎn)者要努力注意并細化與之有關(guān)的所有環(huán)節(jié)。嚴明的

21、紀律和對人員嚴格的監(jiān)督是保證環(huán)境質(zhì)量適用于無菌工藝的必要要求。對在控制環(huán)境中工作的所有人員的培訓(xùn)是很關(guān)鍵的，微生物監(jiān)測計劃中人員責(zé)任心也是同樣至關(guān)重要，因為而在微生物取樣過程中，潔凈工作區(qū)域也可能產(chǎn)生意外的污染。在高度自動化的操作過程中，監(jiān)測人員應(yīng)是應(yīng)該是最直接接觸操作區(qū)域內(nèi)的關(guān)鍵區(qū)域和表面的人員。微生物取樣時，不恰當(dāng)?shù)娜蛹夹g(shù)或人員進入或接近關(guān)鍵區(qū)域都可能帶來微生物污染。必須制定一個培訓(xùn)計劃以使污染風(fēng)險降到最低。所有進入控制環(huán)境人員的培訓(xùn)都應(yīng)當(dāng)有書面記錄。雖然干預(yù)不可避免，但監(jiān)測活動要求將干預(yù)降至最低，所以檢測人員必須盡可能接近完美地掌握無菌技術(shù)。設(shè)備管理應(yīng)必須保證所有在潔凈室和高級無菌工藝

22、環(huán)境操作的人員都要非常熟悉微生物實驗相關(guān)的準(zhǔn)則。培訓(xùn)應(yīng)包括，對無菌技術(shù)基本原理的說明，還有生產(chǎn)的相關(guān)程序和產(chǎn)生污染的潛在原因的處理程序之間的關(guān)系。進行監(jiān)督、審計和檢查微生物控制與檢測活動的人員必須熟知微生物學(xué)的基本原理、微生物的生理特征、衛(wèi)生與消毒、培養(yǎng)基選擇與制備、分類系統(tǒng)級滅菌知識。還應(yīng)對監(jiān)督和測試人員進行微生物或環(huán)境微生物的理論知識的培訓(xùn)。取樣人員等在潔凈室單獨工作的人員還應(yīng)牢記將降低微生物污染風(fēng)險的責(zé)任。進行微生物鑒定的人員要按規(guī)定的實驗室方法進行特殊的培訓(xùn)。必須對操作人員提供額外的管理環(huán)境數(shù)據(jù)的收集訓(xùn)練。認識和了解適用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程是至關(guān)重要的，尤其是當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中規(guī)定了在環(huán)境條件

23、達到某些情況，必須執(zhí)行糾正措施的情況下。理解解污染控制的原理同理解藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMPs）樣都是培訓(xùn)計劃中不可分割的一部分的，其中也應(yīng)包括對數(shù)據(jù)進行調(diào)查和分析。人是控制環(huán)境中微生物污染的唯一重要來源。由于人會帶來污染和無菌工藝的最終目的降低最終用戶的風(fēng)險，只有健康的人員才能進入控制環(huán)境。即使是在高級無菌技術(shù)如隔離器、灌/封/裝系統(tǒng)或封閉的RABS中，生病的人也不允許進入無菌工藝環(huán)境。不能忽略良好的個人衛(wèi)生和對無菌更衣過程細節(jié)的關(guān)注的重要性。根據(jù)控制環(huán)境級別和系統(tǒng)本身標(biāo)準(zhǔn)的不同，更衣程序也有所不同。無菌工藝環(huán)境要求無菌衣必須具有最好的濾過性能。要求盡可能全地覆蓋住皮膚，袖口或帶子在關(guān)鍵的

24、手套-袖子連接處應(yīng)盡可能少地露出。在傳統(tǒng)的潔凈室中，在任何條件下都不能看見暴露的皮膚。，人員和更衣在RABS中與在傳統(tǒng)潔凈室中是同等重要的。當(dāng)員工正確地進行更衣后，還必須時刻小心地維護手套、口罩和衣服的完整性。隔離器的操作人員不必穿無菌衣，但在隔離器、RABS和潔凈室中的無菌操作中，無菌技術(shù)的缺乏和人員脫落的污染仍然是最基本的危害。手套和袖管組合發(fā)生的泄露可以將微生物從機器轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品中。在隔離器或RABS的手套外面或里面套上第二層手套可以增加手套泄露的安全水平或者作為完整性測試的措施。同時，操作人員必須謹記：在隔離器和RABS系統(tǒng)中，無菌技術(shù)要求所有操作必須在戴手套的情況下進行。環(huán)境監(jiān)測計劃本

25、身并不能檢測到無菌生產(chǎn)過程中的破壞環(huán)境微生物質(zhì)量的所有事件，因此必須進行周期性的培養(yǎng)基灌裝實驗或無菌工藝模擬研究，以進行全面的持續(xù)不斷地監(jiān)督，確保操作控制和培訓(xùn)效果的維持。微生物環(huán)境監(jiān)測計劃的設(shè)計和執(zhí)行中的關(guān)鍵因素綜合的環(huán)境監(jiān)測計劃出現(xiàn)以后，它們在不利趨勢或漂移的確定方便的應(yīng)用就得到了重視。在現(xiàn)在無菌工藝環(huán)境中，無論是在隔離器、RABS或傳統(tǒng)的潔凈室中，污染增加變得十分稀有，盡管如此，監(jiān)控計劃也應(yīng)當(dāng)能檢測到設(shè)施中驗證狀態(tài)的變化，并為實施適當(dāng)?shù)挠嫈?shù)提供信息。環(huán)境監(jiān)測計劃應(yīng)根據(jù)特定的設(shè)施和條件進行調(diào)整，也必須在數(shù)據(jù)信息方面有助于進行全面的規(guī)劃。在無菌取樣方法存在技術(shù)限制的背景下，某一天一個單一的不

26、相關(guān)的數(shù)據(jù)可能并沒有實質(zhì)意義。培養(yǎng)基的選擇一般的微生物培養(yǎng)基如大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基（SCDM）因為能使細菌、酵母菌和霉菌生長，適合大多數(shù)條件下的環(huán)境監(jiān)測。可以在這些培養(yǎng)基中加入添加劑使之克服或減少消毒劑或抗生素的影響。生產(chǎn)者應(yīng)該關(guān)注霉菌和酵母菌的檢測，如有必要，可以使用沙氏、改良沙氏或抑制霉菌瓊脂等普通的真菌培養(yǎng)基。一般來說，對專性厭氧菌不起作用，因為這些生物在環(huán)境氣體中不可能存活。但是在無菌工藝中可能觀察到微需氧菌。如果存在缺氧條件（如在無菌測試設(shè)施中對這些微生物的鑒別或無菌檢查71），應(yīng)能保證微需氧菌和生物體的監(jiān)測在低氧條件下的生長。每種用于環(huán)境監(jiān)測的培養(yǎng)基，包括用于回收特定類型微生物的培

27、養(yǎng)基必須進行促生長能力的評價（無菌檢查71）。培養(yǎng)條件的選擇一旦已選擇了合適的培養(yǎng)基，則要選定合適的培養(yǎng)時間和溫度。一般來說，對于一般微生物生長培養(yǎng)基，如大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度在2035C范圍內(nèi)，使用的培養(yǎng)時間不少于72小時。當(dāng)已知污染物生長緩慢時，可以延長培養(yǎng)時間。上述的溫度范圍并不是絕對的。一般設(shè)施環(huán)境中常見的嗜溫細菌和霉菌可以在較寬的溫度范圍內(nèi)生長。對于大多數(shù)嗜溫微生物來說，在超過約20C的溫度范圍下回收是可能的。如果沒有足夠的保證，一個碟子微生物可以在較低或較高的溫度下都進行培養(yǎng)。首先在低溫下進行培養(yǎng)，確保比較重要的與人類密切相關(guān)的革蘭氏陽性球菌的生長。培養(yǎng)及制備過程中的滅菌操

28、作必須進行驗證。當(dāng)在監(jiān)測中使用選擇性培養(yǎng)基時，培養(yǎng)條件必須考慮現(xiàn)有技術(shù)的要求。在采樣過程中應(yīng)禁止向潔凈室中引入污染，所以嚴禁使用污染的培養(yǎng)基或設(shè)備。尤其應(yīng)注意的是無菌采樣培養(yǎng)基的使用。無論什么情況下，采樣培養(yǎng)基和包裝必須進行嚴格的濕熱、射線或其他合適的方式滅菌。如果必須使用滅菌制備的培養(yǎng)基，分析員必須先進行預(yù)培養(yǎng)，并且在進入潔凈室之前目視觀察所有采樣用培養(yǎng)基。如需進一步了解有關(guān)微生物實驗室操作和控制的信息，請參考微生物實驗室操作規(guī)范.采樣計劃和采樣點的評估在最初啟用或授權(quán)潔凈室或其他控制環(huán)境的同時，應(yīng)確定空氣采樣和表面采樣的位置。取樣點必須考慮接近接近暴露的產(chǎn)品容器、封口物品和與產(chǎn)品接觸的表面

29、。在無菌工藝中，產(chǎn)品容器、封口物品和產(chǎn)品暴露的區(qū)域常叫做關(guān)鍵區(qū)域-通常為ISO5級。為了無菌操作的需要，整個關(guān)鍵區(qū)域應(yīng)是無菌區(qū)域。非滅菌物品，包括潔凈室操作人員戴手套的手或隔離器/RABS中的手套在無菌操作前或無菌操作中都不能和滅菌產(chǎn)品、容器封口、灌裝臺或輸送設(shè)備直接接觸。操作者和環(huán)境監(jiān)測人員都不能觸摸傳送裝置、灌裝針頭、組裝加料斗或其他任何一個產(chǎn)品輸送過程中的設(shè)備。這樣才能保證在無菌操作結(jié)束時最完美地進行表面監(jiān)測。采樣頻率取決于在環(huán)境中進行的生產(chǎn)工藝?？傮w的生物負荷水平較低的非無菌產(chǎn)品生產(chǎn)區(qū)，環(huán)境監(jiān)測的頻率可相對較低。實施封閉操作，如發(fā)酵、無菌API工藝和化學(xué)操作的環(huán)境的監(jiān)測點可更少，頻率更

30、低，因為周圍環(huán)境導(dǎo)致微生物污染的風(fēng)險較低。無菌工藝生產(chǎn)的環(huán)境監(jiān)測比最終滅菌之前的產(chǎn)品灌裝環(huán)境監(jiān)測更加關(guān)鍵。最終滅菌之前的產(chǎn)品灌裝操作的監(jiān)測數(shù)量取決于受殘留產(chǎn)品影響的程度和微生物污染的繁殖能力。對隨后的滅菌有影響的微生物鑒別和技術(shù)比對周圍生產(chǎn)環(huán)境的微生物監(jiān)控要關(guān)鍵的多。不可能對每一種生產(chǎn)環(huán)境的微生物控制水平加以建議。例如，一個ISO7級環(huán)境已確定的微生物控制水平在另一個IS07級環(huán)境下不一定合適，這主要取決于每個環(huán)境下的生產(chǎn)活動。用戶應(yīng)進行預(yù)期風(fēng)險分析并為每種控制環(huán)境的取樣點和取樣頻率建立依據(jù)。潔凈室的級別有助于確立控制水平，但并不意味著在同一級別下所有房間應(yīng)具有相同的控制水平和相同的監(jiān)測頻率。

31、監(jiān)測應(yīng)能反映生產(chǎn)或工藝活動中的微生物控制的要求。正式的風(fēng)險評估技術(shù)可以形成一個科學(xué)有效的污染控制程序。表2給出了頻率漸減的、與重要性或取樣取產(chǎn)品風(fēng)險相關(guān)的采樣頻率。這個表格對人員無菌更衣的無菌工藝環(huán)境和不需無菌更衣的環(huán)境進行了區(qū)別。環(huán)境監(jiān)測計劃的檢測頻率應(yīng)是靈活的，取樣點應(yīng)根據(jù)觀測到污染數(shù)和持續(xù)的風(fēng)險分析進行調(diào)整。在長期觀測的基礎(chǔ)上，生產(chǎn)者可以增加或減少預(yù)定的取樣點或者是取消一個采樣點。過度采樣和采樣過疏對污染控制都是不利的，謹慎地考慮風(fēng)險和減少污染源都可以指導(dǎo)采樣密集度。表2：無菌工藝區(qū)的建議采樣頻率采樣區(qū)域/采樣點潔凈室關(guān)鍵區(qū)域（IS05級或更好區(qū)域）氣體采樣表面監(jiān)測關(guān)鍵區(qū)域的鄰近區(qū)域所有

32、采樣其他非鄰近區(qū)域的無菌區(qū)所有采樣隔離關(guān)鍵區(qū)域（IS05級或更好區(qū)域）氣體采樣表面監(jiān)測隔離器周圍的非無菌區(qū)所有采樣在這些環(huán)境中的操作人員均應(yīng)進行無菌更衣（無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)區(qū)域或其他不需要完全無菌更采樣頻率/RABS每次運轉(zhuǎn)輪換時操作結(jié)束時每次運轉(zhuǎn)輪換時每天次普器每天次活動結(jié)束時每月一次隔離器周圍環(huán)境除外）。這些推薦值不適用于衣的控制環(huán)境。潔凈室和無菌工藝區(qū)采樣點的選擇ISO14644給出了一個的潔凈區(qū)微粒空氣分級的表格。這個方法適用于確定總體的空氣微粒指標(biāo)是否達到了設(shè)計要求。雖然，一般來講，這個沒有人活動的表格值可能具有一定的污染風(fēng)險，但在進行微生物污染風(fēng)險分析時也有一定的價值。微生物污染與操作

33、人員密切相關(guān)，所以無人環(huán)境的微生物監(jiān)測的價值有限。微生物采樣點的選擇需要考慮生產(chǎn)操作過程中人員的活動。在潔凈室評定階段的觀測和繪圖可以提供活動和人員位置的有效信息。這些觀測也可以得到頻繁的熟練操作和干預(yù)的重要信息。潔凈室內(nèi)人員的位置和活動與對環(huán)境和環(huán)境中的生產(chǎn)操作的污染風(fēng)險有相關(guān)性。應(yīng)選擇合適的取樣點，因此應(yīng)評價區(qū)域內(nèi)的人員活動和工作的影響，尤其是在關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)的干預(yù)和操作。最可能的污染路線是空氣攜帶，因此，在風(fēng)險評估中，與暴露的滅菌物料附近的空氣攜帶污染有關(guān)的樣品是最關(guān)鍵的。其他需要考慮別的區(qū)域是設(shè)備和物料從較低級別向較高級別傳遞點。門和氣鎖的周圍及內(nèi)部也應(yīng)包含在監(jiān)測日程內(nèi)。習(xí)慣上對墻壁、地面

34、進行取樣，在這些位置的真實的取樣可以提供消毒計劃的有效性的信息。在這些位置的取樣可以相對地不經(jīng)常進行，因為這里的污染不可能影響產(chǎn)品。操作人員應(yīng)禁止觸摸地面和墻壁，從這些表面至產(chǎn)品暴露的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)的機械傳輸污染不應(yīng)發(fā)生。生產(chǎn)者通常進行的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)的表面監(jiān)測應(yīng)在操作結(jié)束時進行。應(yīng)當(dāng)避免培養(yǎng)基和濕拭子上的稀釋液在表面上的殘留，因為它們能導(dǎo)致微生物的繁殖。清潔表面上的稀釋液或培養(yǎng)基需要人為的干預(yù)和活動，這可能會將微生物污染帶至關(guān)鍵區(qū)域，也可能擾亂氣流。潔凈室、隔離器和RABS的微生物控制參數(shù)自從20世紀80年代早期，生產(chǎn)者們便確立了警戒限和行動限的環(huán)境監(jiān)測水平。近年來，警戒限和行動限的數(shù)值差異已經(jīng)變得

35、很小，尤其是在IS05級環(huán)境下。微生物試驗中的生長和回收在土O.5log10之間小幅變動。實際上。對微生物氣體取樣器的研究顯示通常的氣體采樣設(shè)備能產(chǎn)生10倍的差異。因為這些內(nèi)在差異和不可控的取樣錯誤，設(shè)定的的警戒限例如為1cfu和行動限為3cfu并不具有分析意義。數(shù)值的變化并不是符合科學(xué)邏輯的，也不一定是人為活動影響的結(jié)果，可以將正常變化范圍的變化看成是預(yù)期以內(nèi)的變化。實際上，變化值達到5-10倍時，可以看做是有意義的變化。因為微生物生長的準(zhǔn)確度和精密度與回收試驗的局限性，分析員可以考慮污染檢測到的頻率，而不是某個樣品中檢測到的cfu數(shù)。這也不是簡單地微生物直接計數(shù)，而是對可能由一簇微生物引入

36、的污染的檢測。應(yīng)對確定每個潔凈室環(huán)境的污染回收率，一個點和房間的污染回收率發(fā)生變化表明需要采取糾正措施。ISO5級的關(guān)鍵區(qū)域的空氣攜帶或表面污染的回收率在現(xiàn)有方法水平下應(yīng)達到1%或更低。在已有的監(jiān)測方法的基礎(chǔ)上，封閉的RABS和隔離器的污染回收率應(yīng)明顯更低,并檢測到小于1%。同一采樣周期內(nèi)一個環(huán)境內(nèi)多個點觀測到污染表明產(chǎn)品的污染風(fēng)險增加，并應(yīng)謹慎地評估。多個點幾乎同時出現(xiàn)污染也可能是來源于低劣的取樣技術(shù)，因此在做出關(guān)于失控趨勢的分析前應(yīng)謹慎地進行回顧。在污染后對一個環(huán)境重新取樣幾天不具有什么價值，因為一次取樣和另一次取樣進行時的條件并不完全一致。無菌衣也能產(chǎn)生表面樣品。必須重視操作時的人員取樣

37、，為了避免其他污染，最好是在生產(chǎn)結(jié)束時進行。這些取樣點的平均值應(yīng)小于1%。封閉的rabs和隔離器的手套應(yīng)達到比污染回收率0.1%更嚴格的要求。由于微生物取樣方法的內(nèi)在差異，污染回收率是一個在趨勢結(jié)果方面比關(guān)注某個取樣點的數(shù)值變化方面更有用的參數(shù)。表3列出了無菌工藝環(huán)境推薦的污染回收率。事件率是指環(huán)境樣品發(fā)現(xiàn)微生物污染的比率。如，事件率為1%意味著1%的樣品發(fā)現(xiàn)了污染，而不管這個污染是不是菌落。也就是，99%的樣品是完全沒有污染的。在進行低風(fēng)險活動的相似房間，污染回收率比表3中的推薦值高也是可以接受的。當(dāng)污染回收率趨勢在持續(xù)一段時間內(nèi)高于推薦值，應(yīng)該采取一定的行動。表3推薦的無菌環(huán)境初始污染回收

38、率房間級別動態(tài)空氣樣品（%）沉降碟（9cm）/暴露4小時（）接觸碟（）手套或衣服（）隔離器/封閉的RABS（IS05或更好）0.10.10.1IS051111IS063333IS075555IS0810101010在這些環(huán)境中的操作人員均應(yīng)進行無菌更衣（隔離器周圍環(huán)境除外）。這些推薦值不適用于無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)區(qū)域或其他不需要完全無菌更衣的控制環(huán)境。檢出頻率的制定應(yīng)根據(jù)實際的監(jiān)控數(shù)據(jù)制定，并每月進行評估。行動限應(yīng)根據(jù)實驗操作能力制定。如果檢出頻率超過了表3的推薦值或者超出了確定的生產(chǎn)能力，應(yīng)實施糾正措施糾正措施包括但不限于下列內(nèi)容：回顧消毒計劃，包括抑菌劑的選擇、使用方法和頻率。增加人員操作的監(jiān)視

39、，可能包括無菌方法和技術(shù)的書面評價?；仡櫸⑸锶臃椒ê图夹g(shù)。當(dāng)手套和無菌衣的污染回收水平高出正常水平時，糾正措施還應(yīng)包括對更衣操作的額外培訓(xùn)。有效的短暫偏離一個IS05環(huán)境的樣品在15cfu以上的偏離，無論是空氣、表面或人員都應(yīng)當(dāng)極少發(fā)生。在這些偏離在ISO5的接近產(chǎn)品和組分的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)發(fā)生時，都表明嚴重的失控。因此所有ISO5中15cfu的偏離都應(yīng)進行細心而全面的調(diào)查。應(yīng)重點關(guān)注回收菌落的非常高的數(shù)值，無論它是單獨存在或與其他回收菌落相關(guān)聯(lián)存在。微生物檢測人員應(yīng)回顧非常高的數(shù)值發(fā)生前至少兩周的回收率，才能發(fā)現(xiàn)其他表現(xiàn)不正常的回收。微生物檢測人員應(yīng)謹慎地考慮所有的回收率，包括通常在1-5cf

40、u之間的回收。在執(zhí)行調(diào)查時，微生物鑒別是一項重要因素。由于獨立的一個偏離幾乎不可能指向一個確定的原因，只能考慮總體相關(guān)測試。當(dāng)沒有明確的科學(xué)數(shù)據(jù)時，要給出一個根本原因是不明智的。同時，也要了解微生物分析的多變性實際上，沒有一個科學(xué)的原因能將25cfu和15cfu進行區(qū)別。在無菌生產(chǎn)工藝中，不應(yīng)將15cfu作為一個有意義的數(shù)值，因為實際上它和14cfu沒什么區(qū)別。微生物檢測人員應(yīng)用他們的方式對偏離進行實際的科學(xué)的判斷。數(shù)據(jù)解釋的進一步思考在高質(zhì)量的無菌工藝環(huán)境中，檢出頻率通常應(yīng)當(dāng)很低?？梢杂斜?的推薦回收率看出，無菌工藝中的多數(shù)樣品可能得到的污染回收率為0。在無菌工藝操作的最關(guān)鍵區(qū)域，希望得到回

41、收污染物的樣品比1%更少。在大多數(shù)使用分離技術(shù)的高級現(xiàn)代無菌工藝中，如隔離器和封閉的RABS，所有的回收率可能都是0.對環(huán)境控制和滅菌保證負責(zé)的微生物檢測人員不應(yīng)當(dāng)將此認為環(huán)境質(zhì)量已達到滅菌狀態(tài)。微生物取樣系統(tǒng)在所有項目的靈敏度是未知的。在環(huán)境監(jiān)測中，0的結(jié)果只意味著結(jié)果在檢測系統(tǒng)的檢測線以下。不應(yīng)當(dāng)從無菌工藝的污染回收的頻率低得到錯誤的安全意識。滅菌保證是通過關(guān)注人類攜帶的污染和最大限度地減少這些污染的設(shè)備設(shè)計特征來最好的實現(xiàn)的。通過合適的設(shè)備設(shè)計和為設(shè)施中的人提供充足的換氣次數(shù)來減少或消除人類的干預(yù)可以最大限度地減少風(fēng)險。其他的風(fēng)險降低因素包括有效的人員和物料活動、對溫濕度的合理控制；其次

42、還有清潔和消毒。預(yù)先分析工藝，通過減少操作干預(yù)降低人類污染風(fēng)險的風(fēng)險分析模式是一個在滅菌保證方便比監(jiān)測方面更有力的工具。環(huán)境監(jiān)測不能證明一批產(chǎn)品的所有方面都是無菌的，也也不能證明是非無菌的。環(huán)境監(jiān)測只能保證在這個工藝中生產(chǎn)系統(tǒng)處于一個持續(xù)、有效的控制狀態(tài)。應(yīng)注意避免通過監(jiān)測結(jié)果得到錯誤的結(jié)論?？諝馕⑸锊蓸幼畛Ｓ玫谋O(jiān)測無菌環(huán)境的工具是撞擊取樣器和離心取樣器。下面列出了一系列常見取樣器，以供參考。選擇、實用性和正確地使用一種特定的取樣器是使用者的職責(zé)。狹縫-瓊脂空氣采樣器（STA）-這個裝置由一個相連的真空源提供動力。采集的空氣通過一個標(biāo)準(zhǔn)狹縫，達到底部緩慢旋轉(zhuǎn)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上?？諝鈹y帶的微粒

43、具有足夠的質(zhì)量撞擊瓊脂表面，并且可培養(yǎng)的微生物在上面生長。一個長的空氣吸氣管用來降低對不定向氣流的擾亂。篩網(wǎng)撞擊式取樣器-裝置由一個盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿的容器組成。單元蓋子是鑿孔的，帶有預(yù)定尺寸的穿孔。真空泵通過蓋子采集一定體積的空氣，空氣中包含微生物的粒子撞擊皮氏培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。一些采樣器具有一系列篩網(wǎng)，不同級的篩網(wǎng)上的孔徑尺寸漸減。這些單元可以根據(jù)微粒通過不同孔徑的小孔落到瓊脂平面來測定包含可觀測微生物的空氣粒子的粒徑分布。離心采樣器-這種裝置包括一個螺旋推進器或渦輪機，將一定體積的空氣推進，然后推進空氣切向撞擊放置在活動塑料平板上的營養(yǎng)瓊脂條。滅菌微生物腔-這是一種單級篩網(wǎng)撞擊采

44、樣器的改良裝置。單元蓋上有特殊分布的約0.25英寸大小的孔。裝置底部有一個含有營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿。真空泵控制空氣運動通過采樣單元。也有使用集成采樣單元和遠程采樣探針的。表面空氣系統(tǒng)采樣器-整個單元包括盛有瓊脂接觸平皿的進樣部分，緊挨著平皿下是一個發(fā)動機和渦輪機推動氣體通過打孔的蓋子到達瓊脂接觸平皿，并通過發(fā)動機排出。也有集成形式的裝置。明膠濾鏡采樣器-在濾鏡底座上一個具有延伸軟管終端的真空泵可以到達關(guān)鍵區(qū)域的角落。濾鏡包括能夠截留空氣微生物的隨機光纖。經(jīng)過一定的暴露時間后，過濾器被在無菌條件下轉(zhuǎn)移并在合適的溶劑中溶解，然后置于合適的瓊脂培養(yǎng)基上評估微生物效力。沉降碟-這個方法被廣泛用作取樣，和作為通過延長暴露時間定性評價環(huán)境的一種廉價方式。有報道數(shù)據(jù)表明沉降碟在暴露4-5小時后可以提供一個適合評價無菌環(huán)境的檢測限度。沉降碟可能對關(guān)鍵區(qū)域尤為有效，因為動態(tài)取樣和無菌操作可能干擾并對環(huán)境造成危害。機械空氣取樣的一個主要缺點是用于測試的有限的取樣體積。當(dāng)控制環(huán)境的空氣微生物水平希望達到每單位體積的污染水平極低時，至少應(yīng)測試1立方米空氣以達到最大靈敏度。通常，狹縫-凝膠采樣器具有80L/min的采樣能力（表面空氣系統(tǒng)的采樣能力稍高）。如