流式 蛋白方法總結(jié)

1、流式與westen在檢測(cè)蛋白表達(dá)方面各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？流式可以檢測(cè)在胞漿中表達(dá)的蛋白嗎？敏感性怎么樣？操作上有什么特殊要求？流式細(xì)胞儀當(dāng)然可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白。流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western. 免疫組化沒有本質(zhì)差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此， 流式不適合檢測(cè)低表達(dá)的蛋白，低表達(dá)的還是采用western （尤其是化學(xué)發(fā)光底物更佳）和 免疫組化更好。當(dāng)然，流式最大的一個(gè)特點(diǎn)就是，可以定量（百分比），如果是高表達(dá)的用 流式細(xì)胞儀非常有優(yōu)勢(shì)。流式檢測(cè)時(shí)要求有抗體，可以是直接標(biāo)記或間接標(biāo)記的熒光抗體。細(xì)胞需要預(yù)先固定處理， 常用的是多聚甲醛、Tri

2、toonX100、75%乙醇等，具體步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)，都有詳細(xì)說 明。熒光抗體標(biāo)記的選擇指南：對(duì)于流式檢測(cè)最初的一步就是選擇何種方法，通常是何種熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體。廠家根據(jù)需 要開發(fā)了各種熒光標(biāo)記的抗體，進(jìn)行選擇時(shí)首先要滿足的就是所選擇的抗體必須在流式上能 夠檢測(cè)，各單位買的流式儀功能不完全一致，首先要和檢測(cè)方進(jìn)行聯(lián)系，看能否檢測(cè)。在附 表里我將常用的熒光標(biāo)記物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)給出，可以參考。有幾個(gè)原則一起說一 下：1、流式檢測(cè)時(shí)首推熒光物質(zhì)直接標(biāo)記的抗體，如果沒有直接標(biāo)記的抗體，用間接發(fā)，即二 抗上標(biāo)記熒光分子同樣可以。不過這增加了處理的難度，處理步驟增多，往往會(huì)不同程度影 響檢測(cè)結(jié)

3、果。2、廠家推出的抗體有一些明確寫明適合流式檢測(cè)，而另一些則表明適合免疫組化.western 等，首選前者，可以保質(zhì)保量，但是后者并不是不可以用，一般來說如果沒有明確的表明適 合流式檢測(cè)的抗體，采用后者也是可以的，不過要注意其檢測(cè)結(jié)果不一定非常理想。3、單抗和多抗均可應(yīng)用。4、綠色熒光蛋白等本身有熒光的物質(zhì)在檢測(cè)時(shí)會(huì)占據(jù)一個(gè)熒光通道，我也曾碰到幾次有人 將轉(zhuǎn)了綠色熒光蛋白的細(xì)胞再采用FITC標(biāo)記的抗體來檢測(cè)目的蛋白（據(jù)說還有人用此方法 得出了滿意的結(jié)果!），豈不知綠色熒光蛋白和FITC是一個(gè)熒光通道，更本不能一起檢測(cè)。5、如果是檢測(cè)淋巴細(xì)胞這類細(xì)胞，經(jīng)常用到多種抗體同時(shí)標(biāo)記，選擇時(shí)切勿選錯(cuò)。我

4、自己 比較傾向于多重標(biāo)記，因?yàn)檫@樣可以減少抗體和細(xì)胞用量，特別是對(duì)于小鼠的血標(biāo)本，經(jīng)常 采到的血量微少，采用多重標(biāo)記更有利。當(dāng)然這要求流式操作者有較高的水平，注意調(diào)節(jié)流 式儀的各種參數(shù)。請(qǐng)問流式細(xì)胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對(duì)照？首先確認(rèn)你用的直標(biāo)抗體的熒光染料是什么，再確定該抗體的來源種屬，選擇相應(yīng)的同型對(duì) 照。如：你現(xiàn)在想檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞表面的CD4抗原，熒光染料為FITC，抗體來源為大 鼠的IgG1亞型，即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1），你所需要的同型對(duì)照就應(yīng)該是RatIgG1-FITC, 一般的抗體說明上都會(huì)寫清。、流式同型對(duì)照怎樣選擇？同型對(duì)照（Isotyp

5、e Control）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫 球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染 色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum （與一抗相同的正常血清）（must be the same species as primary antibody）0 This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個(gè)可以咨詢?cè)噭┥?。同型?duì)照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì) 照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來源不

6、同，應(yīng)選用相同來源的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照來調(diào)整背 景染色。舉個(gè)例子：比如檢測(cè)一抗為單抗的mouse anti rat CD11b, clone OX-42 purified IgG, 那么它的isotype是mouse IgG2a,所以可以用purified （純化的）mouse IgG2a來做OX-42 的同型對(duì)照（Isotype Control） o 一般的的生物技術(shù)公司和國(guó)內(nèi)的代理都有出售。同型對(duì)照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染 色法，同型對(duì)照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2 a PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā) 熒光、FC受體介導(dǎo)

7、的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對(duì)照與MoAb 所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F： P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相 同為最佳，這對(duì)準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配 的同型對(duì)照，最好為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。很多朋友知道樣品處理時(shí)有個(gè)陰性對(duì)照，用來區(qū)別加藥和不加藥或者其他樣本的狀態(tài).但是對(duì)于流式上的同型對(duì)照，卻不是很了解！一、為什么要用同型對(duì)照？同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的 免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對(duì)照是

8、真正 意思上的陰性對(duì)照，它不但可以用來設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁 瑣的重組細(xì)胞因子競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟。在流式細(xì)胞儀上樣前，染色方式如下：樣本管：一抗+樣本，同型對(duì)照管：同型對(duì)照+樣本二、如何選擇同型對(duì)照？（1）一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體，比 如抗人的CD56 FITC標(biāo)記的抗體，成份是MouseIgG1,K。那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是FITC 標(biāo)記的MouseIgG1,K。注意同型對(duì)照的成份跟它的名稱是相同的.（2）如果是抗體的組合形式是純化的一抗+熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照。比如CD86的純化抗體，成分是MouseIg

9、G1,K。它的同型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,K。它 的二抗PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1,o那么染色方式如下：樣本管：純化的CD86+PE標(biāo)記的抗 Mouse IgG1（二抗）+樣本，同型對(duì)照管：純化的同型對(duì)照+PE標(biāo)記的抗MouseIgG1（二抗）+樣本.如果沒有找到適合的同型對(duì)照，在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同 條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同一一亞型不同一一相同類別。比如，某種的抗 體的來源是Mouse IgG2a,K。如果在同型對(duì)照表里面找到不到完全相同的同型對(duì)照，那么優(yōu) 先選擇相同熒光標(biāo)記Mouse IgG2a為同型對(duì)照。如果也沒有找到Mouse IgG2

10、a，那么優(yōu)先 選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照。如果最后還是沒有找到Mouse IgG2b， 那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。3、哪些客戶需要使用同型對(duì)照？A對(duì)流式不是非常熟悉的客戶。B做胞內(nèi)流式客戶，比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。C使用不常見的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的客戶，因?yàn)榭蛻舨皇煜げ怀Ｒ姌?biāo)志的表達(dá)情 況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽性細(xì)胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié) 合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽性。D對(duì)流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的客戶，一般可以不使用同型對(duì)照。4、為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？

11、首先需要檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或 者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，同型對(duì)照非特異性的結(jié) 合會(huì)超過抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì) 照等。1、同型對(duì)照不是萬能的。同型對(duì)照雖然與試驗(yàn)抗體是同種型，而且具有相同的熒光標(biāo)記， 但不一定是同一廠家生產(chǎn)的，肯定不是同一批次的，也很難保證每個(gè)抗體上標(biāo)記的熒光分子 的數(shù)目是相同的，所以很多情況下發(fā)現(xiàn)用同型對(duì)照調(diào)的參數(shù)并不合適。2、是否需要同型對(duì)照取決于要檢測(cè)的指標(biāo)。對(duì)于一些細(xì)胞特異性的亞群標(biāo)志，比如CD3/4/8這些，對(duì)于某一細(xì)胞來說它或者表達(dá)，

12、 或者不表達(dá)，這時(shí)只要抗體和標(biāo)記技術(shù)沒問題都會(huì)清晰分群，無需同型對(duì)照，甚至不需要陰 性對(duì)照。某些分子在細(xì)胞上原本不表達(dá)，或表達(dá)極低，加入處理因素后表達(dá)明顯上調(diào)，這種通 常也能明顯分群，也不需要同型對(duì)照，但要有未加處理因素的陰性對(duì)照。檢測(cè)細(xì)胞表面活化 分子的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)等通常是這種情況。如果細(xì)胞群中大部分細(xì)胞都表達(dá)要檢測(cè)的目標(biāo)分子，只是有的表達(dá)高些，有的表達(dá)低 些，通常細(xì)胞不能明顯分群。此時(shí)通常需要以同型對(duì)照做參考，雖然它也不一定百分之百正 確。流式檢測(cè)胞內(nèi)抗原時(shí)打孔液的配方？打孔液有很多種，方法也有很多。與你的實(shí)驗(yàn)方法相關(guān)。我用過酒精固定或Triton X-100（我 做的都是培養(yǎng)的細(xì)

13、胞）：（1）70%的酒精固定24小時(shí)即可，不再需要再打孔。如在PI染色測(cè)細(xì)胞周期或凋亡。（2）Triton X-100 是比較強(qiáng)烈的穿孔劑。0.1% Triton X-100/PBS （再加 0.1%BSA）是比較 溫和一點(diǎn)。濃度可適當(dāng)提高。作用時(shí)間以幾分鐘為宜。這個(gè)時(shí)間必須要自己試。時(shí)間長(zhǎng)了細(xì) 胞易破裂，短了則打孔不夠。如果你要染胞漿，則時(shí)間適當(dāng)短些，如果要染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核內(nèi)等， 由于要對(duì)兩層膜性結(jié)構(gòu)打孔，時(shí)間當(dāng)然會(huì)長(zhǎng)一些。為了使得熒光染料能夠更容易地透過細(xì)胞 膜與F-actin特異性結(jié)合，在加染料前就應(yīng)該用0.1%triton x-100處理細(xì)胞5-10min（3）可以試試0.1% sapon

14、in （皂素）saponin -皂素（sigma公司的）我們用的是0.1%的濃度，放在4度保存，能用1-2個(gè)月 配制的方法 saponinIgPBS100ml小牛血清10-15ml對(duì)于淋巴細(xì)胞，透膜的最佳時(shí)間是冰浴15min，長(zhǎng)了或者短了都不好請(qǐng)問下表中流式細(xì)胞儀給出的平均值是什么意思，是怎樣得到的，有些文獻(xiàn)中提到“fluorescence per cell，是下面的mean值嗎，還是要用mean值除以 第1欄的細(xì)胞數(shù)events，才能得到fluorescence per cell ？mean值就是每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，不用再除細(xì)胞數(shù)。這只是個(gè)相對(duì)值，如果求絕對(duì)值， 應(yīng)用已知熒光劑濃度值對(duì)應(yīng)

15、儀器給出的mean值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后你得到的mean值，就 可以根據(jù)這條標(biāo)準(zhǔn)曲線查出真正的熒光濃度值。另外以流式細(xì)胞術(shù)怎樣測(cè)定進(jìn)行所需檢測(cè)物質(zhì)的定量研究？進(jìn)行檢測(cè)物質(zhì)的定量最簡(jiǎn)單的方法就是統(tǒng)計(jì)檢測(cè)蛋白的平均熒光強(qiáng)度。常用的流式檢測(cè)統(tǒng)計(jì) 方法：一個(gè)是陽性率，另外一個(gè)就是平均熒光強(qiáng)度，平均熒光強(qiáng)度是一種觀測(cè)蛋白表達(dá)相對(duì) 定量的簡(jiǎn)單常用方法。細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白越多，其結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體越多，因此其平均 熒光強(qiáng)度就越高。進(jìn)行這種方法檢測(cè)要求每次流式檢測(cè)的機(jī)器條件要完全一致，并且整個(gè)試 驗(yàn)過程不能拖得太長(zhǎng)，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，即使前后使用的儀器條件完全一致，但是機(jī)器 本身的效能也會(huì)改變。我曾經(jīng)觀察過，

16、儀器經(jīng)過半年時(shí)間其效能就要發(fā)生明顯得改變，需要 進(jìn)行光路的調(diào)整。因此，最好整個(gè)試驗(yàn)過程不要超過半年，否則前后的可比性就較差了。 如果你檢測(cè)的是胞內(nèi)分泌性蛋白（如細(xì)胞因子），應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入莫能霉素，以阻 斷細(xì)胞因子的分泌;收獲細(xì)胞后以4%多聚甲醛固定20min，加入0.1Triton X-100破膜10min， 以后步驟與檢測(cè)膜表面分子相同。也可采用皂素進(jìn)行破膜。關(guān)于流式細(xì)胞檢測(cè)后的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 常常有人在檢測(cè)完細(xì)胞后問我如何進(jìn)行結(jié)果的問題。常見的檢測(cè)結(jié)果如有明確的分組和例數(shù)，例如有人檢測(cè)患者在治療前后淋巴細(xì)胞免疫分類的 變化，如果各檢測(cè)了 50例，可以按照常規(guī)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如采用配對(duì)T檢

17、驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 常常見到的是另外一種情形，如有人檢測(cè)一種藥物或者轉(zhuǎn)基因后對(duì)細(xì)胞周期的影響，或者某 種物質(zhì)對(duì)細(xì)胞一種蛋白表達(dá)的影響。像這一類實(shí)驗(yàn)，常常僅僅有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，在得 出結(jié)果后，有人喜歡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，還有人不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，僅給出典型的流式檢測(cè)圖 進(jìn)行描述。兩者都可以，但是要求是必需重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次以上，否則，不可能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 對(duì)于后者，盡管不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。但是必需說明，重復(fù)多少次，結(jié)果基本一致。HO-1活性測(cè)定:根據(jù)HO-1降解血紅素生成膽紅素和CO原理，以樣品反應(yīng)物中膽紅素生成量代表HO-1活性。血清20pl中加入2mmol/L正鐵血紅素血晶素（hemin），美國(guó)Sig

18、ma公司 提供40pl、4.5mmol/L 還原型輔酶II（NADPH，德國(guó) Boehyinger Mannheim 公司提供， Na4-NADPH，純度98%） 40pl，同一只健康豚鼠的肝組織勻漿上清液20pl （作為膽綠素 還原酶的來源）、0.1mol/L的KH2PO4緩沖液（pH 7.4） 1.8ml，避光置37C、10min，將 反應(yīng)物棕色小瓶置于冰上終止反應(yīng)。不含NADPH的樣品作空白對(duì)照，樣品與空白均做雙份， 在分光光度計(jì)上用464nm和530nm雙波長(zhǎng)測(cè)定膽紅素生成量（膽紅素摩爾吸光系數(shù)： 0.025nm/cm），以每小時(shí)每升血清生成膽紅素量nmol/ （h*L）為單位。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程配制固定劑、破膜劑方案一：70%冰乙醇過夜離心后的固定，標(biāo)準(zhǔn)做法是將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷70%酒精，而不是向細(xì)胞中加酒精，這樣 是為了減少細(xì)胞聚集，這一點(diǎn)很重要，很多人都忽視了！一