臍血庫的建立和臍血干細胞移植的臨床研究課件

1、 生物技術(shù)3班 朱建國臍血移植第1頁，共38頁。 臍血是從臍帶和胎盤采集的血，其中含有豐富的干細胞和祖細胞。 干細胞是具有全部或部分分化能力和自我更新能力的細胞。 祖細胞是能夠通過一系列細胞分裂產(chǎn)生特定細胞系的親代細胞。 第2頁，共38頁。 “造血”正是依賴造血干/祖細胞來完成源源不斷的分裂、增殖和分化過程。臍血是替代骨髓進行造血細胞移植的理想的細胞來源，此外，它在基因治療中也有很大的應用潛力。第3頁，共38頁。臍血干/祖細胞的生物學性質(zhì) 人臍血中的造血細胞包括造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSC）以及成熟血細胞的直接祖先，即造血祖細胞（Hematopoieti

2、c progrenitor cells，HPC）。 第4頁，共38頁。 臍血造血細胞的主要特征有： 1）能在體外長期存活； 2）具有廣泛的增殖能力，這可能是由于它們具有快速脫離細胞周期G0/G1期的性質(zhì)； 3）作為以逆轉(zhuǎn)錄病毒為媒介的高效基因轉(zhuǎn)移的理想靶細胞。第5頁，共38頁。 實驗研究和臨床血液移植中，人們往往把CD34抗原作為為鑒定和分離人干/祖細胞的重要標志 。 第6頁，共38頁。CD34 CD34抗原是一種整合的膜糖蛋白，其分子量為90-120kD，可能與細胞間黏附及造血相關基因的表達有關。Gao等將人類CD34+細胞和CD34-細胞作了比較，認為前者的NOD/SCID鼠移植潛能比后者

3、高出100倍以上，也在一定程度上說明了以CD34抗原作為判別依據(jù)的可行性。但不是所有的造血細胞的表面都帶有CD34抗原。 第7頁，共38頁。不同胎齡的胎兒與初生嬰兒相比，臍血造血祖細胞的表型和功能有一定的差別。Wyrsch等比較了懷孕16-34周的不成熟胎兒和足月出生的嬰兒的臍血，發(fā)現(xiàn)循環(huán)（circulating）祖細胞的頻率在懷孕的4-6個月時達到最高，而隨后又線性下降。這表明未足月嬰兒的臍血干/祖細胞具有更強的擴增能力，而在基因治療方面也有更強的應用潛力。第8頁，共38頁。 端粒是所有的真核生物染色體的末端部分，富含G/C重復序列。隨著細胞分裂和分化的不斷進行，端粒的重復片段逐漸丟失，而其

4、長度也逐漸變短。 De Pauw等利用一種新的精確計算方法，并結(jié)合PNA FISH和數(shù)字熒光顯微鏡的應用，發(fā)現(xiàn)臍血干細胞（UCBSC）的端粒平均長度明顯長于成人的骨髓干細胞（BMSC），這被認為是臍血造血增殖潛能高于骨髓的理論依據(jù)之一。第9頁，共38頁。 造血干/祖細胞的生長是由造血細胞因子來調(diào)控的。各種造血因子幾乎都是多效性的，它們對不同細胞行使不同功能。這種功能上的顯著不同依賴于不同的靶細胞，不同的因子濃度以及不同細胞因子的相互作用。在體外培養(yǎng)中細胞因子的加入可能會很大程度地改變細胞的原始表型。Porretti等從兩份臍血中分離純化CD34+細胞后在加有IL-6，IL-11，F(xiàn)L和血小板生

5、成素（TPO）的無血清培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)兩周后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細胞的免疫表型發(fā)生了顯著的改變。這提示上述細胞因子組合具有促進CD34+細胞分化成熟的作用。第10頁，共38頁。CD34+細胞體外擴增兩周的免疫表型變化 細胞表型第一份臍血第二份臍血起始兩周后起始兩周后CD34+CD34+/38-/33-.CD34+/38-/33+.CD34+/38+/33-.CD34+/38-/W90+.CD34+/33+/13+第11頁，共38頁。臍血造血干/祖細胞的分離和純化 臍血造血干/祖細胞的分離和純化是研究臍血造血干/祖細胞和臨床應用的關鍵因素之一，迄今有以下幾種方法用于臍血造血干/祖細胞的分離和純化： 單純離心

6、分離法，該方法分離的干/祖細胞損失率達4080%； 不連續(xù)密度梯度離心法，臍血干/祖細胞主要集中于低密度(近1.063 g/ml)組分中，該方法增加了體外操作的過程，易污染；第12頁，共38頁。 三聯(lián)袋(tripleblood bagsystem)分步離心濃集法，該法可除去59%RBC，體積減少56%，CD34+細胞回收率為87% ； Ficoll、peroll、甲基纖維素、明膠、淀粉等方法，有結(jié)果表明明膠法干/祖細胞損失率較低，集落形成細胞(CFC)、CD34+細胞的回收率分別為92%和86%； 免疫磁珠吸附法(MACS)，生物素-抗生素親和柱法，這些方法具有快速、純度好、產(chǎn)量高等優(yōu)點，現(xiàn)已

7、趨于商品化，并有應用于臨床的報道； 第13頁，共38頁。 流式細胞技術(shù)分選法(FCM)，該方法以流式細胞儀分選CD34+及其亞群細胞純度可高達95%99%，是目前分選CD34+細胞純度最高的方法，但耗時費資，產(chǎn)率并不高，也難保持無菌，目前主要應用于科研。 因此選擇較好的臍血干/祖細胞分離純化的方法既要考慮純度、產(chǎn)率、又要顧及生物學活性及臨床應用的可行性。第14頁，共38頁。臍血的體外擴增根據(jù)Patricia等的定義: 細胞增殖（proliferation）是指從某一特定的細胞群產(chǎn)生新細胞的過程，而不管產(chǎn)生的細胞的類型； 細胞擴增（expansion）是指產(chǎn)生更多保持起始細胞群的特定特征的細胞；

8、 細胞分化（differentiation）是指形態(tài)上可以識別的細胞祖先產(chǎn)生下代細胞，以及特定造血系產(chǎn)生成熟細胞 。第15頁，共38頁。造血干/祖細胞體外生長示意圖 A.起始細胞群能產(chǎn)生新細胞，因此總細胞數(shù)量增加（增殖）。產(chǎn)生的細胞表現(xiàn)出了不同造血系的成熟特征（分化）。然而保持起始細胞特征的細胞數(shù)量卻減少了。 增殖 分化 B.起始細胞群增殖和分化，保持起始細胞特征的細胞數(shù)量不變。增殖 維持 分化 C.起始細胞群增殖和分化，保持起始細胞特征的細胞數(shù)量增加（擴增）。分化 增殖 擴增第16頁，共38頁。通常認為，單份臍血的干細胞量只能滿足體重不大于30kg的兒童，成人應用因數(shù)量不足而受到限制。 根據(jù)

9、Gluckman等人的研究，臍血移植中有核細胞的劑量至關重要。據(jù)報道，高有核細胞劑量對嗜中性粒細胞植入有促進效應，且有核細胞劑量3.7107/kg是預測良好生存的因素之一。鑒于人臍血干/祖細胞在臨床上的重要意義，一些研究小組致力于探索出這些細胞體外擴增的理想條件。第17頁，共38頁。 CD34+細胞的擴增能力除了與胎兒的孕期有關以外，還與不同的細胞周期有關。Summers等研究了分別處于細胞周期的G1和G0期的臍血CD34+細胞的擴增的質(zhì)量和數(shù)量。他們將細胞培養(yǎng)在無血清無基質(zhì)細胞、但添加有SCF，F(xiàn)L-3，TPO的培養(yǎng)基中，通過流式細胞儀計算每周收獲的細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的G0期細胞不但產(chǎn)生更多的

10、CD34+細胞，而且G1細胞群的后裔中表達CD34抗原的細胞比例比G0細胞群下降地快得多。其結(jié)論是G0期的臍血CD34+細胞比G1期的細胞在體外產(chǎn)生祖細胞的能力高1000倍。 第18頁，共38頁。 在培養(yǎng)基中添加胎牛血清是維持和擴增干細胞的常用方法之一， 但是血清中可能存在一些過敏原或感染因子， 如牛海綿狀腦炎或其他朊病毒疾病等。Lazzari等在使用相同的細胞因子組合的條件下比較了三種無血清培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基StemPro 34 SFM（Life Tech- nologies）和CellGro SCGM （CellGenix）擴增有核細胞的能力比培養(yǎng)基X-Vivo 10，（BioWhit-

11、taker）高4倍以上，而擴增CD34+細胞的能力分別高出5倍和7倍以上。Gilmore等發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基QBSF-60的使用可以使CD34+細胞擴增4倍左右。如果要擴增出供成人移植的足夠的干細胞，這種培養(yǎng)基中的細胞快速擴增可以顯著減少所使用的擴增培養(yǎng)基的總量。第19頁，共38頁。 該條件下細胞擴增的機制仍不清楚，有可能是因為血清的FCS中可能包括造血移植因子或分化因子，從而削減了CD34+細胞的數(shù)量。對于細胞生長環(huán)境中可能存在的造血抑制因子，一些研究者采用添加抗體的方法，也有報道在培養(yǎng)基中添加使用不同的基質(zhì)細胞株。第20頁，共38頁。 至今為止絕大多數(shù)的實驗條件都是以使用重組細胞因子為基礎的

12、。Guzmn等認為，在CD34+細胞占總細胞的50%以上時，通過細胞因子的理想組合可以獲得造血細胞的顯著增殖和擴增。許多研究者都認為使用早期作用細胞因子（early acting cyto- kines），如FL（FLT-3配體）和TPO（血小板生成素），對臍血干/祖細胞的體外擴增有很重要的影響。使用含有FL和TPO的培養(yǎng)基，Shadduck實驗室獲得了CD34+細胞20-30倍的擴增。再加入干細胞因子和IL-6到培養(yǎng)系統(tǒng)后，4-6周的體外培養(yǎng)可以獲得CD34+細胞100倍的擴增。Yamaguchi等將臍血CD34+細胞放在加有血小板生成素（TPO）、FLT3/FLT2配體（FL）和干細胞第2

13、1頁，共38頁。 因子（SCF）的、但不含血清的單層人原始骨髓基質(zhì)細胞上培養(yǎng)。培養(yǎng)2和4周以后，CD34+細胞和克隆形成單位分別擴增了100和1000倍以上，而卵石區(qū)域形成細胞也分別擴增了18和60倍。嚴重并發(fā)免疫缺陷紊亂（severe combined immunodeficient disorder，SCID）的小鼠的重建細胞（SRC）分析表明了培養(yǎng)擴增細胞的植入有效性。在可以從干細胞捐獻者或者其受體獲得基質(zhì)細胞的臨床條件下，體外擴增系統(tǒng)具有顯著的應用價值。第22頁，共38頁。臍血庫的建立和臍血干細胞移植的臨床研究 臍血移植的最佳方案之一是利用經(jīng)胚胎選擇的新生兒的臍血來治療其兄弟姐妹的疾病

14、。該技術(shù)于2000年8月在美國首次應用于臨床：為一個患有范尼可貧血的6歲女孩莫利“創(chuàng)造”了一個弟弟，用他的臍血為莫利進行成功的移植。而英國也在日前批準了為一個三歲的地中海貧血患兒人工選擇胚胎，以進行下一步臍血移植。第23頁，共38頁。 臍血移植除了適合于相關供體移植以外，在無關供體移植方面也有令人矚目的應用潛力。Hirose等的研究表明，臍血中的B細胞的IgH的N端明顯短于外周血B細胞，IgH基因幾乎沒有重排，而且B細胞分化相關基因之一的末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶（TdT）不表達，這些都表明來自臍血的B細胞更不成熟。由于臍血細胞獨特的免疫學特性，在移植中最具臨床相關性的HLA的6等位基因只要匹配5種甚

15、至3種即可使用，而臍血移植后發(fā)生移植物抗宿主?。℅VHD）的可能性又要低于骨髓和外周血。第24頁，共38頁。 臍血的進一步開發(fā)和利用必須要求有一個可以隨時獲得的、安全可靠的臍血干細胞來源。1992年美國Arizona大學建立了世界上最早的臍血庫之一， 1994年臍血庫便向公眾開放。至1998年12月僅紐約、Dusseldof、Milan三個主要的臍血庫已凍存一萬份以上的可供移植的無關供體的臍血，從而使接受臍血移植的患者與日俱增。而根據(jù)2000年初的統(tǒng)計，臍血庫已經(jīng)儲備了超過30000份的臍血，實施的兒童臍血移植超過1500例，而應用于成人惡/良性疾病的治療的臍血移植也逐年增加。特別第25頁，共

16、38頁。 值得注意的是，無關供體臍血移植在近幾年迅速發(fā)展，并且已經(jīng)占了總移植數(shù)量的絕大多數(shù)。 歐洲臍血登記處統(tǒng)計的每年無關/相關臍血移植的數(shù)量 第26頁，共38頁。 根據(jù)歐洲臍血登記處2000年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在來自29個國家121個移植中心的527例臍血移植中，138例的供體有親緣關系，而399例無親緣關系。結(jié)果表明臍血移植的存活率與骨髓移植相近。而急性或慢性的移植物抗宿主病的發(fā)病率在臍血移植中卻有明顯的減少，甚至是在HLA不匹配的情況下也是如此。而就骨髓移植來說，HLA必須嚴格匹配。當開始尋找適合的供體到移植實施，5%患者的等待期在2個月以內(nèi)，50%患者的等待期在4個月以內(nèi)，而95%患者的等待

17、期在16個月內(nèi)。這使相當一部分可以第27頁，共38頁。 獲益于骨髓移植的病人在等待合適供體的過程中死亡。成功的配型在少數(shù)人種中則更加困難。 雖然HLA匹配的兄弟姐妹作為供體時的骨髓移植比使用非相關的臍血移植具有更好的臨床效果，但是在沒有合適供體的情況下，臍血移植是一個很好的選擇。Ooi等報道，7個患脊髓發(fā)育不良綜合癥（MDS）相關的二級急性白血病患者在接受HLA不匹配的臍血移植后，五人存活并在7-31個月內(nèi)無疾病。39個患有惡性血液病的兒童在移植第28頁，共38頁。 了無關供體的臍血后，預計的三年無風險存活率為49.2-16.6%。相信隨著臨床經(jīng)驗的不斷積累，臍血移植將會為更多血液或免疫疾病患

18、者帶來福音。第29頁，共38頁。臍血在基因治療中的潛在應用 基因治療是將外源基因轉(zhuǎn)入靶細胞，通過在患者體內(nèi)表達，糾正或治療疾病的過程。臍血干/祖細胞具有很強的自我更新能力和增殖能力，因此是外源基因?qū)氲睦硐胧荏w。雖然轉(zhuǎn)基因的方法很多，但是將目的基因?qū)肽氀?祖細胞的最主要方法是逆轉(zhuǎn)錄病毒導入法。因為臍血干細胞能分泌生長因子，且它們更多處于細胞周期中，這對于采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移至關重要：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能介導處于增殖、分裂中的細胞進行基因轉(zhuǎn)移。第30頁，共38頁。 在臍血移植后的免疫重建中，使用基因修飾的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）在免疫治療中會成為一種預防感

19、染和復發(fā)的有效途徑。在HIV感染的治療方面，也可以利用多種以臍血細胞為受體的基因治療方法，如轉(zhuǎn)導“保護”基因進入臍血細胞，使其在HIV敏感的靶細胞上表達，特別是CD34+淋巴細胞。Wang等也成功地將耐藥基因MGMT和MDR1利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入人臍血CD34+細胞中，這兩種基因的共表達使耐藥性能分別提高了5.8-6.3倍和5倍。這為臨床上改善病人在化療過程中的綜合耐藥性能提供了實驗基礎。第31頁，共38頁。 造血干細胞的轉(zhuǎn)基因和自體移植來治療遺傳性血液疾病和免疫缺陷的最大優(yōu)勢在于，這種療法在提供與異源移植相同益處的同時，能避免可能伴隨的免疫并發(fā)癥。但是由于相當一部分臍血早期祖細胞處于休止期

20、，外源基因轉(zhuǎn)入率較低，這給成功的基因治療帶來了最大的阻礙。一次最近的臨床試驗報道了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療X-連鎖嚴重并發(fā)免疫缺陷的嬰兒，由于基因修正的淋巴球的選擇性生長使免疫系統(tǒng)獲得重建24。Moore研究小組在最佳條件第32頁，共38頁。 下擴增臍血CD34+細胞后，使用DHFR（dihydrofolate reductase）轉(zhuǎn)基因，40%的細胞成功地進行了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導。相信處理造血細胞的更新的方法能獲得轉(zhuǎn)基因和臨床治療的更高效率。 第33頁，共38頁。市場前景 1、白血病為人類三大癌癥之一，每年吞噬無數(shù)人的生命。目前白血病患者的唯一根治方法就是造血干/祖細胞移植（包括骨髓移植和臍帶血移植），重建再造血