Survivin基因反義寡核苷酸與大腸癌細(xì)胞凋亡、血管形成的體

1、Survivin基因反義寡核苷酸與大腸癌細(xì)胞凋亡、血管形成的體內(nèi)試驗(yàn)研究李瑞 黃宗海 姚航 厲周 李強(qiáng)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普通外科，廣東省廣州市 510282李瑞，男，1974年生，河南省鄭州市人，漢族，南方醫(yī)科大學(xué)在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事大腸癌基因治療方面的研究。 HYPERLINK mailto:L L通訊作者：黃宗海，博士，教授，南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普通外科，廣東省廣州市，510282Department of General Surgery，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 510282，ChinaLi Rui

2、, Studying for doctorate, Attending physician, Department of General Surgery，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 510282, China HYPERLINK mailto:L LCorrespondence to: Huang Zong-hai,Doctor,Professor, Department of General Surgery，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 5

3、10282, ChinaStudy on the effect of survivin ASODN in vivo to the apoptosis of colorectal cancer cell and vasiformationAIM: To study on the effect of survivin ASODN to the apoptosis of colorectal cancer cell and vasiformation in nude mice. METHODS: To build the model of colorectal cancer in nude mice

4、,and then we divided into four groups: control group, Lipofectamine group, Lipofectamine+SODN group and Lipofectamine+ASODN group.We compared the final weight of tumor and calculated the suppression rate of tumor. Hematoxylin and eosin stain of tumor tissues were performed for histological examinati

5、on .We detected the expression of survivin and microvessel density (MVD) of tumor and the apoptosis of tumor cell. RESULTS: The results showed that the final weight of tumor had conspicuous difference between Lipofectamine+ASODN group with other groups (P0.05). The pathological change showed that th

6、e growth of tumor was inhibited. The tissue section of tumor showed lamellar zone of necrosis and massive inflammatory cell infiltrate.The microvessel density (MVD) of tumor showed after treatment:control group (19.573.37); Lipofectamine group (21.944.41); Lipofectamine+SODN group (20.493.91); Lipof

7、ectamine+ASODN group (11.302.79). It had conspicuous difference between Lipofectamine+ASODN group with other groups (P0.05).The apoptotic index(AI) showed after treatment: control group (3.531.89); Lipofectamine group (3.862.14); Lipofectamine+SODN group (4.472.30); Lipofectamine+ASODN group (28.452

8、.76). It had conspicuous difference between Lipofectamine+ASODN group with other groups (P0.05). CONCLUSION: It hinted that survivin ASODN can inhibit the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) conspicuously and induce the apoptosis of endothelial cell and the devolution of micrangiu

9、m,which suppress the growth of tumor.目的：研究Survivin反義寡核苷酸對(duì)人大腸癌細(xì)胞裸鼠移植的瘤細(xì)胞凋亡及血管形成的影響。 方法：建立裸小鼠人大腸癌模型，然后將成瘤后的裸小鼠分為空白對(duì)照組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組和脂質(zhì)體ASODN組，治療后測(cè)定瘤重并進(jìn)行比較；將瘤組織進(jìn)行HE染色，檢測(cè)Survivin在瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；用SP法染色檢測(cè)微血管密度(MVD)，用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，并探討Survivin ASODN與MVD、AI之間的關(guān)系。 結(jié)果：ASODN實(shí)驗(yàn)組在第8日后測(cè)定最終瘤重，與各對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異（p0.05）

10、。常規(guī)病理下ASODN實(shí)驗(yàn)組可見腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，腫瘤組織切片中可見片狀壞死區(qū)，而且這些區(qū)域可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?？瞻讓?duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組MVD分別為19.573.37、21.944.41、20.493.91, ASODN實(shí)驗(yàn)組MVD為11.302.79，差異顯著（P0.05）。空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組AI分別為3.531.89、3.862.14、4.472.30，ASODN實(shí)驗(yàn)組AI為28.452.76，ASODN實(shí)驗(yàn)組AI與空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組AI相比，差異顯著（P0.05）。 結(jié)論：Survivin基因反義寡核苷酸可

11、顯著抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和毛細(xì)血管迅速退化，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。關(guān)鍵詞：Survivin基因；反義寡核苷酸；大腸癌模型；微血管密度0 引言在凋亡的調(diào)節(jié)因子中，凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)作為一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子引起了人們的注意，Survivin是由Ambrosini等在1997年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)IAP家族的新成員，大多數(shù)正常組織均測(cè)不到Survivin基因表達(dá)，但在大多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤中呈高度選擇性表達(dá)1，它可以抑制細(xì)胞凋亡，并在新生血管的形成中有重要作用。Survivin反義寡核苷酸（ASODN）具有高度特

12、異性，能夠明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，故本研究旨在探討Survivin反義寡核苷酸對(duì)人大腸癌細(xì)胞裸鼠移植的瘤細(xì)胞凋亡及血管形成的影響。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于2006-05/12在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和珠江醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4-6周齡BALB/C 裸小鼠，體重(19.21.3)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。12 主要試劑人大腸癌Lovo細(xì)胞由解放軍廣州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供；陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipofectamine TM2000)購(gòu)自Invitrogen公司；鼠抗人CD34單克隆抗體為SantaCruz(美國(guó))公司產(chǎn)品。Survivin正、反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成：根

13、據(jù)Survivin的基因序列(Genbank Accession NumberU75285)，應(yīng)用primer5.0軟件設(shè)計(jì)互補(bǔ)于Survivin mRNA的232-251序列的20個(gè)堿基組成的ASODN鏈，序列為5-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3，同時(shí)合成正義鏈，序列為5- CGCAGTAGCTGCGCTGATTG -3，兩條序列每端5個(gè)磷酸基采用硫代修飾，由上海生工生物工程公司合成。1.3 方法細(xì)胞培養(yǎng)：水浴復(fù)蘇人大腸癌細(xì)胞株Lovo后接種于30 ml培養(yǎng)瓶，在37，5 % CO2培養(yǎng)箱中用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。裸小鼠人大腸癌模型的建立：將對(duì)數(shù)生

14、長(zhǎng)期的人大腸癌細(xì)胞Lovo單細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為3.5105/ ml，取0.2 ml接種于每只裸鼠的一側(cè)背部靠左后肢處。接種后每天觀察注射點(diǎn)有無破潰紅腫，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)分組及處理：將24只成瘤后的裸小鼠隨機(jī)分成4組，為空白對(duì)照組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組和400 ng/ ml濃度的脂質(zhì)體ASODN組。各組均同時(shí)于成瘤后1，4，8d向瘤體內(nèi)直接注射相應(yīng)的試劑0.2 ml，定期觀察皮下移植瘤生長(zhǎng)情況。人大腸癌裸小鼠皮下移植瘤體積和重量的測(cè)量：分別于第一次注射后第1，4，8d觀測(cè)裸小鼠腫瘤體積變化，并測(cè)量瘤體大小，8d后斷頸處死裸小鼠，取腫瘤稱重。腫瘤體積=

15、ab2/2 mm3(a:長(zhǎng)徑,b:短徑)。光鏡觀察：將處死后的裸小鼠部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后連續(xù)4um切片，HE染色，光鏡下觀察人大腸癌移植瘤細(xì)胞形態(tài)變化。微血管密度(MVD)的檢測(cè)：按Vltrasensitive TMS-P超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)說明進(jìn)行操作。在低倍鏡(40)選取切片中3個(gè)血管密度最高區(qū)域(排除腫瘤出血及邊緣反應(yīng)區(qū))，然后在高倍鏡下(400)計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的血管數(shù)量，其平均值即為腫瘤的MVD。脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)凋亡細(xì)胞：應(yīng)用細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim公司)染色，細(xì)

16、胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野(400)，計(jì)數(shù)1000個(gè)癌細(xì)胞中陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)/1000100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（顯著性水準(zhǔn)0.05）。2 結(jié)果2.1 Survivin ASODN對(duì)人移植瘤的抑制作用各實(shí)驗(yàn)組初始瘤體體積方差分析無顯著差異，第8日后斷頸處死裸小鼠，測(cè)定最終瘤重，ASODN實(shí)驗(yàn)組與各對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異（p0.05），各對(duì)照組之間無顯著性差異。表1 各組移植瘤初始瘤體體積及最終瘤重（s)Table1 the beginning volume

17、 and final weight of tumor of the groups（s)分組n瘤體體積（mm3）最終瘤重（mg）空白對(duì)照組648.421.42498.1413.90脂質(zhì)體對(duì)照組646.592.08502.6811.24脂質(zhì)體SODN對(duì)照組647.442.05506.2010.40脂質(zhì)體ASODN組647.221.58238.418.26*F值1.058843.095P值0.3890.000注：*：與空白對(duì)照組比較，P0.052.2 移植瘤病理變化（見圖1）HE染色后，光鏡下見各對(duì)照組人大腸癌移植瘤細(xì)胞密集成群，細(xì)胞多為多邊形，核大深染。而ASODN實(shí)驗(yàn)組可見腫瘤細(xì)胞較少，分布稀疏

18、，有變性的液化壞死灶，癌細(xì)胞皺縮變圓，胞核固縮，核深染。Survivin ASODN與MVD、AI之間的關(guān)系檢測(cè)腫瘤組織MVD（見表2、圖2）：空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組MVD分別為19.573.37、21.944.41、20.493.91, ASODN實(shí)驗(yàn)組MVD為11.302.79，差異顯著（P0.05）。各實(shí)驗(yàn)組測(cè)定凋亡指數(shù)：空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組AI分別為3.531.89、3.862.14、4.472.30，ASODN實(shí)驗(yàn)組AI為28.452.76，ASODN實(shí)驗(yàn)組AI與空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組AI相比，差異顯著（P0.

19、05）。表2 各組移植瘤MVD（s)Table2 MVD of tumor of the groups（s)分組nMVD空白對(duì)照組919.573.37脂質(zhì)體對(duì)照組921.944.41脂質(zhì)體SODN對(duì)照組920.493.91脂質(zhì)體ASODN組911.302.79*F值14.896P值0.000注：*：與空白對(duì)照組比較，P0.05表3 各組移植瘤AI（s)Table3 AI of tumor of the groups（s)分組nAI空白對(duì)照組93.531.89脂質(zhì)體對(duì)照組93.862.14脂質(zhì)體SODN對(duì)照組94.472.30脂質(zhì)體ASODN組928.452.76*F值256.766P值0.00

20、0注：*：與空白對(duì)照組比較，P0.053 討論Survivin 是一個(gè)新的凋亡抑制蛋白，由142個(gè)氨基酸組成，N端含有一個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列，其中含有對(duì)抑制凋亡有重要作用的氨基酸殘基Pro33、Trp67和Cys84，survivin通過這些殘基與caspase-3和caspase-7結(jié)合抑制caspase的活性，阻止多種凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡2-6。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子。Survivin 選擇性的在腫瘤組織中表達(dá)而在正常成熟的組織中不表達(dá)，并且參與了細(xì)胞周期的調(diào)控和新生血管的生成，因而Survivin 成為腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)7。Survivin 是生長(zhǎng)因

21、子誘導(dǎo)血管形成中的保護(hù)性基因，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管的形成中有重要作用。有研究表明8，體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的刺激下，Survivin 表達(dá)上調(diào) 16 倍，其 mRNA 水平在610 小時(shí)達(dá)高峰，24 小時(shí)后開始下降，體外形成的三維血管與二維培養(yǎng)物相比，內(nèi)皮細(xì)胞 Survivin 的表達(dá)顯著增加。另外，在正常皮膚的非增殖性的毛細(xì)血管內(nèi)皮中 Survivin 表達(dá)量很低，而在體內(nèi)肉芽組織中的新生血管中 Survivin

22、的表達(dá)量很高。1984年，Izant和Weintraub提 出 了“ 反 義 核 酸 (antisense oligodeoxyribonucleotides，ASODN)”的概念9，即根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工或生物合成的特定互補(bǔ)的 DNA 或 RNA 序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，形成mRNA-DNA 或 mRNA-RNA 雜交雙鏈，從而抑制或封閉目的基因的表達(dá)，使其喪失活性，達(dá)到基因控制和治療的目的。應(yīng)用Survivin基因反義寡核苷酸可消除血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（endothelial growth factor，VEGF）在血管形成中的細(xì)胞保護(hù)作用10。我們?cè)O(shè)計(jì)合成了互補(bǔ)于Survivin mRNA的23

23、2 -251序列的20個(gè)堿基組成的ASODN鏈，于400 ng/ ml濃度向瘤體內(nèi)直接注射，使得微血管密度(MVD)顯著降低，并與空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，脂質(zhì)體SODN對(duì)照組差異顯著。本研究結(jié)果顯示抑制生長(zhǎng)因子表達(dá)，就可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和毛細(xì)血管迅速退化，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，這是Survivin基因反義寡核苷酸抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。Survivin反義寡核苷酸目前已被認(rèn)為是腫瘤的理想反義靶向治療標(biāo)志，隨著基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步深入，它必將應(yīng)用于臨床，成為惡性腫瘤的一種有效地治療手段。4 參考文獻(xiàn)1 Ambrosini G,Adida C,Altieri D C.A novel anti

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