蛋白質(zhì)鹽析法提取

1、蛋白質(zhì)鹽析法提取1 中性鹽沉淀（鹽析法）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是：成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡(jiǎn)單、安全。對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。 中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥腃OOH、NH2和OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間

2、的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個(gè)：即電荷和水膜。因?yàn)橹行喳}的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。鹽析示意圖如下頁“圖 4”所示。 中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：1) 溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（04）進(jìn)行。由下表可以看到， 硫銨在0時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：表2-1 幾種鹽

3、在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 1012) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。4) 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。 鹽析的操作方法最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免

4、局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。 鹽析曲線的制作如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)：蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽和度鹽析的影響因素1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.53.0，相當(dāng)于25 mg/mL30mg/mL。2) pH值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。3) 溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶