模擬酶的概念和認(rèn)識(shí)

1、第八章酶的人工模擬hh教學(xué)目標(biāo)了解抗體酶、印跡酶等人工酶（模擬酶）等新型酶的設(shè)計(jì)、原理和典型應(yīng)用。教學(xué)重點(diǎn)抗體酶的制備原理和應(yīng)用；生物印跡酶的原理和應(yīng)用。教學(xué)方法以課堂講授為主，課前布置學(xué)生自學(xué)和準(zhǔn)備。引入模擬酶就是根據(jù)酶的作用原理，模擬酶的活性中心和催化機(jī)制，用化學(xué)合成方法制成的高 效、高選擇性、結(jié)構(gòu)比天然酶簡(jiǎn)單、具有催化活性、穩(wěn)定性較高的非蛋白質(zhì)分子的一類(lèi)新型催 化劑，也稱(chēng)酶的合成類(lèi)似物?；蛘呓忻改Ｐ突蛘呓腥斯っ?。一、模擬酶的概念1、模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制：過(guò)渡態(tài)理論對(duì)簡(jiǎn)化的人工體系中識(shí)別、結(jié)合和催化的研究2、超分子化學(xué)主-客體化學(xué)：主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)超分子：

2、該分子形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，當(dāng)接受體與 絡(luò)合離子或分子結(jié)合形成穩(wěn)定的，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，形成超分子。功能：分子識(shí)別、催化、選擇性輸出二、模擬酶的分類(lèi)和制備根據(jù)Kirby分類(lèi)法：?jiǎn)渭兠改Ｐ停夯瘜W(xué)方法通過(guò)天然酶活性的模擬來(lái)重建和改造酶活性。機(jī)理酶模型：通過(guò)對(duì)酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來(lái)指導(dǎo)酶模型的 設(shè)計(jì)和合成。單純合成的酶樣化合物：化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡(jiǎn)單分子。按照模擬酶的屬性：主-客體酶模型膠束酶模型肽酶半合成酶抗體酶分子印跡酶模型2.1主-客體模型2.2.1環(huán)糊精模擬酶環(huán)糊精由淀粉通過(guò)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶降解制得；是由。-毗

3、喃葡萄糖單元以a -1, 4-糖 苷鍵相互結(jié)合成互為椅式構(gòu)象的環(huán)狀低聚糖，其分子通常含有612個(gè)毗喃葡萄糖單元。有實(shí)用 意義的是含6、7、8個(gè)毗喃葡萄糖單元的a、8、y -環(huán)糊精，但a -環(huán)糊精空腔較小，Y -環(huán)糊 精價(jià)格昂貴，常用的是8 -環(huán)糊精。水解酶的模擬Bender等人將實(shí)現(xiàn)了電荷中繼系統(tǒng)的?；复呋课灰?D的第二面，成功地制備出人工 酶8 -Benzyme。催化對(duì)叔丁基苯基醋酸酯(p-NPAc)的水解比天然酶快一倍以上；kcat/Km也與 天然酶相當(dāng)。Rama等人將咪唑在N上直接與8 -CD的C-3相連，所得的模型2催化p-NPAc的水解比天然酶快 一個(gè)數(shù)量級(jí)。WTlCOOPNPF

4、eFe以二茂鐵為結(jié)合位點(diǎn)的硝基苯酯(如模型3)，以CD本身為催化劑可加速酯水解達(dá)105106倍。核糖核酸酶的模擬牛胰核糖核酸酶：124氨基酸殘基；His12, His119, Lys41在它的催化下RNA的磷酸酯水解 分兩步進(jìn)行，兩個(gè)咪唑基交替起著廣義酸堿催化的作用。4的催化下水解反應(yīng)只生成C； 5催化水解反應(yīng)只生成B。環(huán)糊精底物復(fù)合物的幾何形狀和催化基團(tuán)所處的位置對(duì)反應(yīng)的選擇性起了決定性的作用。2.2.2冠醚化合物的模擬酶1）冠醚定義：分子中具有-（CH2CH2O）n-重復(fù)單元的環(huán)狀醚，1962年首次合成的冠醚形狀似皇冠 而得名:命名：x 一冠一y： x一環(huán)上的原子總數(shù)，y一氧原子數(shù)15一冠

5、一5日本學(xué)者Koga等人采用冠醚為主體，合成了帶有巰基的仿酶模型。利用此模型可在分子內(nèi)實(shí)行“準(zhǔn)雙分子反應(yīng)”以合成多肽。此模型具有結(jié)合兩個(gè)氨基酸的能力。COOHCOOH圖6-11帶疏基的仿博模型2.2膠束模擬酶模擬水解酶的膠束酶模型：組氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性中心必需的催化基團(tuán)。如將表面活性劑分子上連接上組氨酸殘基或咪唑基團(tuán)上，就有可能形成模擬水解酶的膠束。N- 十四?；M氨酸所形成的膠束催化對(duì)硝基苯酚乙酸酯的水解，其催化效率比不能形成膠束慚-乙?；M氨酸高3300倍。2.3 肽酶（pepzyme）肽酶就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。設(shè)計(jì)合成29肽TrPepz模 擬了

6、胰蛋白酶的活性部位，在水解2個(gè)或2個(gè)以上串聯(lián)的賴(lài)氨酸和精氨酸殘基的化學(xué)鍵時(shí)，TrPepz 比胰蛋白酶的活性更強(qiáng)。2.4半合成酶以天然蛋白或酶為母體，用化學(xué)或生物學(xué)方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，或改變其 結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶”。通過(guò)選擇性修飾氨基酸側(cè)鏈將一種氨基酸側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈稱(chēng)為化 學(xué)誘變法。Bender等人首次成功地將枯草桿菌蛋白酶活性部位的絲氨酸（Ser）殘基，經(jīng)苯甲基 磺酰氟特異性活化后，再用巰基化合物取代，將絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。雖然產(chǎn)生的巰基化枯 草桿菌蛋白酶對(duì)肽或酯沒(méi)有水解活力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯酯等。Hilvert等人利用類(lèi)似的方法，

7、將枯草桿菌蛋白酶結(jié)合部位的特異性Ser突變?yōu)槲腚装?酸。此硒化枯草桿菌蛋白酶既表現(xiàn)出轉(zhuǎn)氨酶的活性又表現(xiàn)出含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性。2.5抗體酶2.5.1概念抗體酶又稱(chēng)催化性抗體，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶屬性。2.5.2歷史1948年P(guān)auling的預(yù)言：酶的催化作用是由于酶在催化化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，活性中心同底物 的過(guò)渡態(tài)或高能反應(yīng)中間體產(chǎn)生互補(bǔ)，從而加速化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。Jencks1969年的假設(shè)：抗體若能與化學(xué)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)結(jié)合則這樣的抗體必具有催化性能。 以此推理，抗體若能與過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物結(jié)合,則它也會(huì)與化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的過(guò)渡態(tài)結(jié)合，這樣的抗 體亦具有催化性能。198

8、6年，Lerner和Schultz兩個(gè)研究小組獨(dú)立發(fā)表了關(guān)于芳香酯和碳酸酯的抗體催化水解的報(bào) 道，首次人工制得抗體酶（催化抗體）。2.5.3制備原理設(shè)計(jì)過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物，作為半抗原結(jié)合載體分子免疫動(dòng)物，得到抗體酶。2.5.4 抗體酶的應(yīng)用在有機(jī)合成中的應(yīng)用：催化天然酶不能催化的反應(yīng)催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)不利的反應(yīng)催化立體專(zhuān)一性的反應(yīng)闡明化學(xué)反應(yīng)機(jī)制催化抗體在醫(yī)療上的應(yīng)用吸毒(如可卡因和鴉片)是困繞著很多國(guó)家的難題，尤其是吸毒上癮后很難戒毒。直接拮抗 可卡因上癮的拮抗物至今沒(méi)找到，促進(jìn)戒毒的藥物如desipramine也需要幾個(gè)星期的誘導(dǎo)才能有 效，且效果不理想。一個(gè)可替換的方法是阻斷可卡因和受體的結(jié)合，但

9、是必須使用高劑量藥物。Landry等用可卡因降解的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物磷酸單酯產(chǎn)生的單克隆抗體3B9催化可卡因降解， 此抗體酶的催化活性比血液中分解可卡因的丁酰膽堿酯酶要高，水解后的可卡因片斷失去了刺 激功能，因此，用人工抗體酶的被動(dòng)免疫也許能提供阻斷可卡因上癮的治療，從而達(dá)到戒毒的 目的。2.5.5催化抗體研究前景抗體酶篩選催化效率的問(wèn)題模擬酶的展望模擬酶的研究近年來(lái)進(jìn)展比較大，但現(xiàn)階段模似酶無(wú)論在催化效率，還是在專(zhuān)一性上都還 比較差，要達(dá)到實(shí)際應(yīng)用還要有大的技術(shù)和理論突破。但是，最終的結(jié)果必定是發(fā)展了酶學(xué)理 論，指導(dǎo)了生產(chǎn)實(shí)踐。解決了人類(lèi)遇到的難題，造福了全人類(lèi)。三、印跡酶3.1分子印跡技術(shù)概述3

10、.1.1分子印跡原理分子印跡(Molecular imprinting)是制備對(duì)某一化合物具有選擇性的聚合物的過(guò)程。 這個(gè)化合物叫印跡分子(print molecule)也叫做模板分子(template)。功能單體通過(guò)與模板分子相互作用聚集在模板分子周?chē)纬赡撤N可逆的復(fù)合物功能單體與過(guò)量交聯(lián)劑在致孔劑存在下發(fā)生共聚生成高聚物將模板分子從高聚物中解離出來(lái)，結(jié)果，形成的聚合物內(nèi)保留有與印跡分子的形狀、 大小完全一樣的孔穴。制備選擇性聚合物的過(guò)程-在印跡分子和交聯(lián)劑存在下通過(guò)光和熱啟動(dòng)集合作用形成聚合物研磨聚合物抽提印跡分子得到選擇性聚合物MIPM-單體;CR-交聯(lián)劑;P-印跡分子分子印跡可遵照如下

11、兩種方法：印跡分子被共價(jià)、可逆結(jié)合在單體分子上；單體與印跡分子之間的最初作用是非共價(jià)的。3.1.2用可逆共價(jià)結(jié)合可得到能拆分糖的外消旋混合物的聚合物印跡分子：苯基一a D甘露毗喃糖苷單體：兩分子4乙烯基苯基硼酸交聯(lián)劑：乙二醇二甲丙烯酸酯(EDMA)存在下發(fā)生共聚反應(yīng)，得到印跡聚合物。經(jīng)酸水解除掉印跡分子苯基一a D甘露毗喃糖苷后，則所得聚合物中留有與印跡分子形狀 一樣的孔穴，孔穴內(nèi)還帶有硼酸基團(tuán)。由于該聚合物可以可逆的選擇性的結(jié)合印跡分子，所以 可拆分這個(gè)糖的外消旋混合物。圖6-30苯基一a-D甘露毗喃糖苷作印跡分子，與單體乙烯基苯基硼酸發(fā)生作用，形成共 價(jià)復(fù)合物（1）;（1）與EDMA共聚后

12、形成印跡聚合物（2）；除掉印跡分子后得（3）, 它能可逆的選擇性的結(jié)合模板分子。圖6-31用圖6-30制備的印跡聚合物層析分離模板分子的外消旋混合物3.1.3非共價(jià)相互作用制造的聚合物Mosbach等用模板分子的氨基與單體羧基之間的非共價(jià)相互作用制造的聚合物可用來(lái)根據(jù) 底物選擇性和對(duì)映體選擇性分離氨基酸衍生物。圖6-34利用非共價(jià)相互作用的分子印跡。（a）L-苯丙氨酰苯胺（R = C6H5 ）和丙烯 酸之間的離子或其他相互作用決定“印跡部位”的形狀、大小和性質(zhì)。與EMDA交聯(lián)并抽提模 板分子后，該聚合物對(duì)L-苯丙氨酸酰苯胺有選擇性（b）為在此聚合物層析柱上拆分外消旋 的D,L-苯丙氨酰苯胺。3

13、.1.2表面分子印跡無(wú)機(jī)物為載體的表面印跡:在某些載體表面產(chǎn)生分子印跡空腔或進(jìn)行表面修飾產(chǎn)生印跡結(jié)合部位的過(guò)程稱(chēng)為表面分 子印跡。例如在硅膠球表面的分子印跡：首先將3-（三甲氧基硅烷基）甲基丙烯酸通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合到 硅膠表面，引入聚合單體甲基丙烯酸酯，待印跡分子與單體共同包被在硅膠表面后，采用常規(guī) 的聚合方式聚合，然后去除印跡分子后，就產(chǎn)生了具有一定粒度不溶脹的表面印跡微粒。這種 印跡方法特別適于制備拆分對(duì)映體的聚合物。固體材料的表面修飾:雙西佛堿的二硅氧烷分子與硅膠表面的硅羥基縮合，其他硅羥基用戊基甲基硅烷保護(hù)起來(lái) 以防止產(chǎn)生非特異性吸附作用。待用硼氫化鈉還原除去聯(lián)苯二醛后，就產(chǎn)生了兩個(gè)有一定

14、距離 的氨基。這樣的二氨基對(duì)恰當(dāng)長(zhǎng)度的二醛具有很好的選擇結(jié)合能力。蛋白質(zhì)的表面印跡:3.1.3生物印跡生物印跡街。諭?口說(shuō)3削是分子印跡的一種形式，它是指以天然的生物材料，如蛋白質(zhì) 和糖類(lèi)物質(zhì)為骨架，在其上進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對(duì)印跡分子具有特異性識(shí)別空腔的過(guò)程。原理：生物分子構(gòu)象的柔性在無(wú)水有機(jī)相中被取消，其構(gòu)象被固定，因而模板分子與生物 分子在水溶液中相互作用后產(chǎn)生的構(gòu)象變化在移入無(wú)水有機(jī)相后才能得以保持。用酒石酸作用于牛血清白蛋白，然后凍干，再用有機(jī)溶劑抽提酒石酸，最后得到酒石酸印 跡的牛血清白蛋白。印跡的白蛋白在無(wú)水乙酸乙酯溶劑中結(jié)合酒石酸的量是未印跡蛋白結(jié)合酒石酸的30倍。印跡曲線(xiàn)1和未

15、印跡曲線(xiàn)2白蛋白作用的時(shí)間過(guò)程曲線(xiàn)(a)無(wú)水二異丙醚中結(jié)合對(duì)羥基苯甲酸;(b)在無(wú)水乙酸乙酯中結(jié)合L-酒石酸3.2分子印跡酶通過(guò)分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類(lèi)似于酶的活性中心的空腔，對(duì)底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，更 重要的是利用此技術(shù)可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)，并與底物定向排列。3.2.1印跡底物及其類(lèi)似物Mosbach等人應(yīng)用分子印跡法制備具有催化二肽合成能力的分子印跡酶。印跡分子：分別以底物混合物（Z-L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸1:1混合）以及產(chǎn)物二肽為印跡 分子。單體：甲基丙烯酸甲酯為聚合單體，交聯(lián)劑：二乙撐甲基丙烯酸甲酯為交聯(lián)劑經(jīng)聚合產(chǎn)生了具有催化二肽合成能力的二肽合成酶。研究表明以產(chǎn)

16、物為印跡分子的印跡聚 合物表現(xiàn)出最高的酶催化效率，在反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)后，其二肽產(chǎn)率達(dá)到63%，而以底物為印跡分 子的印跡聚合物催化相同的反應(yīng)時(shí)二肽產(chǎn)率卻較低。3.2.2印跡過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物與用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作模板分子制備的印跡聚合物也能結(jié)合反應(yīng)過(guò)渡態(tài)，降低反應(yīng)活化能， 從而加速反應(yīng)。這類(lèi)研究中最早的一個(gè)例子是用對(duì)-硝基苯乙酸酯水解反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物對(duì)-硝基苯甲 基磷酸酯作模板分子制備聚合物。制得的MIP證明能優(yōu)先結(jié)合過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物，并能加速對(duì)硝基苯 乙酸酯水解成對(duì)硝基酚和乙酸。圖6-44針對(duì)過(guò)度態(tài)類(lèi)似物對(duì)-硝基苯甲基磷酸酯制備的印跡聚合物能加速酯水解成相應(yīng) 的羧酸3.3生物印跡酶3.3.1有機(jī)相生物印跡酶Braco等人將適當(dāng)兩親性的表面活性劑與酶印跡，待表面活性劑分子與酶充